目的:探究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染对胃上皮细胞m~6A甲基化修饰的影响,及其介导FTO调控RNF4表达在感染细胞DNA损伤反应和侵袭迁移中的作用。方法:1.Hp感染对细胞m~6A甲基化修饰的影响及其介导FTO在感染细胞侵袭迁移中的作用:(1)Hp以MOI为60:1感染胃上皮细胞GES-1、AGS 24h,m~6A斑点印迹实验检测细胞总RNA m~6A修饰水平,实时荧光定量PCR和Western blot检测m~6A甲基化修饰相关酶FTO、METTL3和YTHDF2的表达。(2)生物信息学分析FTO、METTL3和YTHDF2在胃癌中的表达及预后,FTO表达与胃癌临床病理参数的关系和功能富集。(3)免疫组织化学技术检测人胃癌组织中FTO表达和Hp感染蒙古沙鼠胃组织FTO表达。(4)构建敲低FTO基因的稳转细胞系,Western blot检测FTO表达;Hp感染FTO基因敲低细胞,m~6A斑点印迹实验检测细胞m~6A甲基化修饰水平。(5)细胞划痕实验和Transwell实验检测Hp感染FTO基因敲低细胞的迁移侵袭能力。2.Hp介导FTO通过m~6A去甲基化修饰对RNF4表达的影响:(1)生物信息学预测FTO m~6A修饰靶基因。(2)Hp感染FTO基因敲低细胞,Western blot检测RNF4表达水平,Me RIP-q PCR检测RNF4 m~6A水平。3.RNF4在Hp诱导胃上皮细胞DNA损伤反应和侵袭迁移中的作用:(1)免疫组化和生物信息学分析RNF4在胃癌中的表达及功能富集。(2)RNA干扰技术下调GES-1、AGS细胞中RNF4基因表达,Western blot验证RNF4的表达水平,彗星实验检测细胞DNA损伤情况,Western blot检测DNA损伤关键蛋白γ-H2AX、P53和RAD51的表达。(3)构建过表达RNF4稳转细胞系,并用Hp感染,Western blot检测RNF4及DNA损伤修复关键蛋白P53和RAD51表达,免疫荧光技术检测γ-H2AX和RAD51的表达及定位,用彗星实验检测细胞DNA损伤情况。(4)细胞划痕实验、Transwell实验检测敲低RNF4和Hp感染过表达RNF4的胃上皮侵袭迁移能力。结果:1.Hp上调FTO基因表PF-03084014核磁达降低感染细胞总m RNA m~6A甲基化水平,促进感染细胞迁移和侵袭:(1)与未感染组相比,Hp感染的胃上皮细胞总RNA m~6A甲基化修饰水平下降,FTO m RNA和蛋白表达升高,METTL3和YTHDF2 m RNA和蛋白表达降低。(2)生物信息学分析显示,胃癌组织中FTO和YTHDF2m RNA表达高于正常组织,METTL3 m RNA表达低于正常组织;FTO高表达与胃癌患者的预后呈负相关,与胃癌患者的T分期、M分期以及AJCC分期等病理参数呈正相关联;FTO参与调节m RNA甲基化,RNA稳定性,DNA损伤修复,细胞增值、代谢等过程。(3)免疫组化结果显示胃癌组织BMS-354825中FTO蛋白的表达水平显著高于癌旁组织,Hp感染蒙古沙鼠胃组织中FTO表达同样高于对照组织。(4)成功构建敲低FTO的细胞系,与空载组相比,敲低FTO的胃上皮细胞总RNA m~6A水平显著升高;与敲低FTO细胞相比,Hp感染FTO敲低细胞,FTO表达升高,细胞总m RNA m~6A水平降低。(5)与非感染组相比,Hp感染显著提高细胞的迁移侵袭能力;与空载组相比,敲低FTO基因抑制细胞迁移和侵袭能力,且敲低FTO抑制Hp感染细胞的迁移侵袭能力。2.Hp介导FTO通过m~6A甲基化修饰下调RNF4表达:(1)RM2 Target网站预测RNF4存在m~6A修饰位点,是FTO的一个m~6A修饰靶蛋白。(2)与空载组相比,敲低FTO引起RNF4 m~6A水平升高,上调RNF4蛋白表达。(3)与敲低FTO细胞相比,Hp感染FTO敲低细胞,FTO表达升高,引起RNF4 m~6A水平下调,RNF4表达水平下降,提示Hp可介导FTO通过去m~6A甲基化修饰下调RNF4表达。3.Hp下调RNF4表达参与胃上皮细胞DNA损伤反应和侵袭迁移:(1)Hp感染蒙古沙鼠胃组织中RNF4蛋白表达降低,生物信息学分析显示RNF4在胃癌组织中低表达;RNF4主要参与了细胞应激反应和DNA损伤修复,进而参与肿瘤的发生和发展。(2)sh RNF4转染GES-1、AGS细胞中RNF4表达降低;与非感染组相比,Hp感染细胞DNA拖尾变长;与Hp感染空载组相比,Hp感染RNF4敲低细胞加重基因组DNA损伤;与空载组相比,敲低RNF4的细胞DNA损伤修复关键蛋白P53、RAD51表达降低。(3)过表达RNF4基因的GES-1、AGS细胞中RNF4表达升高;与非感染组相比,Hp感染细胞中DNA拖尾变长,RAD51和P53稳定性降低;与空载组相比,过表达RNF4上调RAD51和P5immunocompetence handicap3蛋白水平;与过表达RNF4组相比,Hp感染过表达RNF4基因细胞DNA损伤程度降低,细胞核内γ-H2AX和RAD51聚集加快,P53、RAD51稳定表达,提示过表达RNF4基因可以减轻Hp感染引起细胞的DNA损伤。(4)与空载组相比,敲低RNF4促进胃上皮细胞迁徙和侵袭,过表达RNF4降低细胞侵袭迁移能力;与Hp感染空载组相比,Hp感染过表达RNF4细胞侵袭和迁移能力降低。结论:(1)Hp可上调FTO表达降低感染细胞的m~6A水平,促进细胞迁移和侵袭。(2)Hp可通过FTO去m~6A修饰下调RNF4表达。(3)Hp下调RNF4表达参与其感染细胞的DNA损伤反应和侵袭迁移。