目的:通过体外实验,观察黄芪复方颗粒(Huang Qi compound granules,HQCGs)对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞(Rat mesangial cells,RMCs)衰老的作用,探讨HQCGs抗高糖诱导RMCs衰老的作用机制。材料与方法:依据血清药理学制备HQCGs含药血清。采用CCK-8法检测RMCs增殖活性。根据细胞形态学变化、SA-β-gal染色阳性率、细胞周期分布评估RMCs衰老。采用荧光探针DCFH-DA检测RMCs内ROS水平。采用Western blot检测Sirt1/Foxo1信号转导通路相关蛋白表达。加入Sirt1特异性抑制剂EX527抑制Sirt1蛋白表达后,检测相关蛋白表达、SA-β-gal染色阳性率、ROS水平。结果1.CCK-8法检测细胞增更多殖活性正常组细胞增殖活性随时间延长而升高(P<0.01);高糖组细胞增殖活性则随时间延长而降低(P<0.01)。在24h,与正常组比较,高糖条件下体外培养的RMCs增殖活性明显升高(P<0.01);48h-72h,与正常组比较,高糖组细胞增殖活性随时间延长而下降(P<0.01)。在24h,HQCGs组细胞增殖活性明显低于高糖组(P<0.01),与正常组无明显差异(P>0.05)。随时间延长,在48h-72h,与高糖组比较,HQCGs组细胞活性明显升高(P<0.01),表现出时间依赖性。在48h时间点,与高糖组比较,HQCGs低、中剂量组细胞增殖活性浓度依赖地提高(P<0.01);高剂量组细胞增殖活与高糖组无明显差异(P>0.05)。2.细胞形态学变化正常的RMCs呈梭形或星形,立体,单核,边界清晰。衰老的RMCsselleck化学体积增大,失去原有形状,扁平,细胞内颗粒增多,双核、多型核细胞增多,边界不清。在24h,各组间细胞形态未见明显差异。在48h-72h,与正常组比较,高糖组细胞体积增大,失去原有形状,扁平,细胞内颗粒增多,双核、多型核细胞增多,边界不清,上述衰老特征随时间延长而加重。使用HQCGs含药血清干预后,细胞体积缩小,恢复梭形或星形,形态立体,细胞内颗粒减少,单核细胞增多,双核、多型核细胞减少,边界清晰。选取细胞状态更为稳定、可控的48h时间点,观察不同浓度HQCGs对细胞形态学改变的影响。发现,对比高糖组,低、中剂量组细胞形态趋于正常,高剂量组细胞形态则与高糖组无明显差异。3.SA-β-gal染色阳性率正常组细胞β-gal表达较少,但仍可观察到其染色阳性细胞数随时间延长而缓升高(P<0.05);高糖组细胞染色阳性率则随时间延长而明显升高(P<0.01)。在24h,各组间细胞衰老染色阳性率无明显差异(P>0.05)。在48h-72h,对比正常组,高糖组细胞衰老染色阳性率随时间延长而明显升高(P<0.01)。在48h-72h,与高糖组比较,HQCGs组细胞衰老染色阳性明显降低(P<0.01),作用以48h最佳。在48h,对比高糖组,HQCGs低、中剂量组细胞染色阳性率随浓度升高而明显下降(P<0.05,P<0.01);高剂量组细胞染色阳性率与高糖组无明显差异(P>0.05)。4.细胞周期分布在48h,与正常组比较,高糖组停滞于G0/G1期细胞明显增多,S期、G2/M细胞明显减少(P<0.01)。高糖组比较,低、中剂量组G0/G1期细胞百分比明显减少,S期、G2/M细胞明显增多,呈浓度依赖(P<0.01);与高糖组比较,高剂量组G0/G1期、S期细胞无明显差异(P>0.05)。5.DCFH-DA检测细胞内ROS水平实验发现,正常组细胞内ROS水平随时间延长而缓慢升高(P<0.01)。高糖作用于RMCs 24h、48h、72h,细胞内ROS水平随时间延长而显著升高(P<0.01comprehensive medication management)。对比高糖组,HQCGs作用于RMCs 24h和72h,细胞内ROS水平均有下降(P<0.05);在48h,HQCGs组细胞内ROS水平明显下降。在48h,与高糖组比较,HQCGs低、中剂量组细胞内ROS水平随浓度升高而下降(P<0.05);高剂量组细胞内ROS水平高于高糖组(P<0.01)。6.Western blot检测Sirt1/Foxo1信号转导通路相关蛋白表达变化选取48h、中剂量HQCGs作为最佳作用时间、最佳作用浓度,检测Sirt1/Foxo1信号转导通路相关蛋白表达。在48h,与正常组比较,高糖组细胞内Sirt1、Foxo1蛋白表达降低(P<0.01)。与高糖组比较,HQCGs中剂量组细胞Sirt1、Foxo1蛋白表达升高(P<0.05)。7.加入Sirt1特异性抑制剂EX527为进一步验证HQCGs对RMCs作用与Sirt1/Foxo1信号转导通路的关系,加入Sirt1特异性抑制剂EX527抑制Sirt1蛋白表达。与HQCGs中剂量组比较,HQCGs中剂量组+100nmol/L EX527组细胞Sirt1、Foxo1蛋白表达水平明显下降(P<0.05),SA-β-gal染色阳性率明显升高(P<0.01),细胞ROS水平明显升高(P<0.01)。结论:1.高糖可以加速体外培养的RMCs衰老进程,细胞衰老程度随时间延长而加重。2.HQCGs能够延缓高糖环境下的RMCs衰老。3.HQCGs延缓高糖诱导RMCs衰老的作用可能是通过上调Sirt1/Foxo1通路相关蛋白表达,减轻氧化应激而实现的。