研究背景和目的糖尿病创面是糖尿病常见并发症,具有病程长、易复发等特点,给患者带来极大困扰,探寻其病理机制及治疗具有重要意义。巨噬细胞和成纤维细胞是创面中的重要效应细胞。现发现ADAM-10调控细胞粘附、生长、迁移等过程。但ADAM-10在糖尿病创面中的具体机制尚不明确。本研究探究ADAM-10在巨噬细胞、成纤维细胞中的调控作用;及其在糖尿病创面愈合过程中的作用机制;结合药物治疗创面,验证研究结果。研究方法1.临床上筛选慢性难愈合创面,随机分组:湿润暴露疗法/湿润烧伤膏(MM)组、重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(rb-b FGF)组。在治疗第3、10天,取肉芽及少量上皮组织,免疫荧光(IF)染色ADAM-10、MMP-12,观察蛋白变化特点。2.对sh ADAM-10 RAW264.7细胞进行蛋白组学分析,筛选差异蛋白,并进行生物信息学分析。3.对RAW264.7和J774a.1细胞,进行sh ADAM-10(sh)或EX ADAM-10(EX)干预,随后给予脂多糖(LPS)或MMP-12抑制剂+LPS(MMP-12inh+LPS)刺激,检测细胞活力、基因转录、蛋白表达等情况Staurosporine生产商。4.对L929成纤维细胞进行EX干预,随后LPS刺激,观察细胞活力、ADAM-10以及其它蛋白表达水平。5.正常、糖尿病大鼠分别制备创面,分组为急性(Acute)组、模型(Model)组、MM组以及rb-b FGF组。观察第3、7、10、14天的创面情况;创面率;病理结构;亚细胞结构;ADAM-10转录水平;蛋白表达及定位情况。结果1.慢性难愈合创面治疗第3天,MM组内ADAM-10、MMP-12表达均低于rb-b FGF组。相较于治疗第3天,第10天ADAM-10表达增加;MMP-12降低;MM增加ADAM-10作用低于rb-b FGF;rb-b FGF降低MMP-12作用明显。2.sh RAW264.7细胞蛋白组学检测结果显示:干扰ADAM-10影响创面愈合相关的多种生物学过程,并导致MMP-12和AKT降低。3.巨噬细胞中(1)对较于CON组,1000ng/ml的LPS作用9 h～24 h增加细胞活力(P<0.05);1.5μmol/L的MMP-12inh作用12 h～36 h对细胞活力无影响(P>0.05)。LPS作用12 h显著降低ADAM-10、增加MMP-12基因转录水平(P<0.01);LPS增加MMP-12、i NOS、TNF-α转录水平以及ADAM-10分泌(P<0.05或0.01);促进ADAM-10、MMP-12、i NOS、IL-10和cyclin D1的蛋白表达(P<0.05)。MMP-12inh增加pro-ADAM-10、IL-10和cyclin D1的蛋白表达(P<0.05)。(2)细胞活力在sh细胞各组均低于CON组(P<0.01),在sh细胞含LPS的组别均低于LPS组(P<0.01)。J774a.1与RAW264.7两细胞受干预后细胞活力变化相似。对比CON组,LPS组、MMP-12inh+LPS组以及sh细胞所有组别ADAM-10转录均降低(P<0.01);MMP-12转录水平在所有含LPS的组别中均增加,在sh组降低(均为P<0.01)。对比LPS组,其它含LPS的组别MMP-12转录均降低(P<0.0https://www.selleck.cn/products/CP-690550.html1)。(3)对比EX阴性转染组,EX各组细胞活力均高于EX阴性组(P<0.01);EX细胞内含LPS的组别其活力高于EX阴性+LPS组(P<0.01)。对比EX阴性或EX阴性+LPS组,含MMP-12inh的组中TNF-α分泌量均降低(P<0.05)。EX组内ADAM-10、MMP-12、炎性因子的基因转录及蛋白表达均增加(vs EX阴性组,P<0.05)。sh组内则反之。EX阴性+LPS组MMP-12、i NOS、TNF-α、Arg1、TGF-β1、cyclin D1以及CD206的转Genetically-encoded calcium indicators录水平增加(vs EX阴性组,P<0.01);且这一增加作用在EX+LPS组被进一步提高(vs EX阴性+LPS组,P<0.01)。在EX细胞含LPS的组别内ADAM-10分泌量增加(vs EX阴性组,P<0.05)。EX与EX+LPS组内ADAM-10、MMP-12、IL-6以及IL-10的蛋白表达量增加(vs EX阴性,P<0.05)。IF染色ADAM-10、Arg1和i NOS显示出与Western Blot相近的实验结果。4.对比L929细胞的EX阴性组,EX组细胞活力增加(P<0.01);且EX+LPS组细胞ADAM-10分泌量增加(P<0.05);LPS及EX增加ADAM-10、p-AKT、AKT、TNF-α蛋白表达(P<0.05)。在EX+LPS组中LPS的促蛋白表达作用进一步增加(vs EX阴性+LPS,P<0.05)。5.糖尿病大鼠创面各时间点,Model组创面率高于Acute组(P<0.05);MM组和rb-b FGF组创面率低于Model组(P<0.05)。MM和rb-b FGF两种治疗能减轻创面中炎性细胞的浸润;促进胶原生成;改善细胞内内质网和线粒体的结构;降低创面组织TNF-α蛋白量,而增加TGF-β1、ADAM-10、IL-10、Arg1、p-AKT蛋白表达,降低MMP-12、i NOS、IL-6的表达(vs Model,P<0.05);IF显示:给药组创面第10天ADAM-10、第7天创面巨噬细胞的Arg1表达均高于Model组;Model组第10天的i NOS表达量始终高于其它组;此外,ADAM-10主要定位于肌成纤维细胞中。结论1.巨噬细胞中,ADAM-10通过调控MMP-12促进炎性细胞因子表达,参与LPS诱导的巨噬细胞活化。2.成纤维细胞中,ADAM-10通过增加AKT及其磷酸化,增加TNF-α,促进细胞增殖。3.在体实验中,ADAM-10增加可促进糖尿病大鼠创面愈合。具体机制是成纤维细胞ADAM-10增加促进细胞增殖;巨噬细胞中MMP-12降低减轻创面炎症反应。且该分子机制在MM和rb-b FGF治疗糖尿病创面中得到了验证。