狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染所引起的一种人兽共患传染病,每年造成全球死亡人数超过59,000人。狂犬病一旦发病致死率几乎为100%,目前仍无Aurora Kinase抑制剂有效的治疗药物与方法。RABV进入细胞后释放的基因组主要由细胞中的模式识别受体视黄酸诱导基因蛋白I(Retinoic acid-induciselleck产品ble gene I,RIG-I)识别,RIG-I识别病毒RNA后激活下游信号转导通路,激发宿主先天性免疫反应。RABV的P蛋白具有多功能性,在病毒复制和先天免疫逃逸中发挥着重要作用。前期研究发现P蛋白既能拮抗宿主干扰素(Interferon,IFN)产生,也可以抑制IFN介导的信号通路,是病毒中最主要的Ⅰ型IFN拮抗剂。然而,P蛋白拮抗Ⅰ型IFN产生的详细分子机制和精确位点尚不清楚。本实验室前期研究表明,RABV固定毒株和野毒株感染对IFN通路的激活能力不同。本研究中发现固定毒株CVS和野毒株DRV的P蛋白抑制IFN激活的能力不同,通过对CVS-P和DRV-P进行疏水性分析和区域互换,发现DRV-P上172-182氨基酸区域对其抑制干扰素调节因子3(IFN regulatory factor 3,IRF3)激活至关重要;接着对两株P蛋白172-182氨基酸区域进行序列比对和位点突变,发现P蛋白179位点丝氨酸(Serine,Ser)是其抑制IFN产生所必需的,当179位点由Ser突变为脯氨酸(Proline,Pro)时,P蛋白抑制IRF3激活的能力显著减弱。通过对RIG-I通路中的关键分子进行蛋白互作筛选,发现179位点为Ser的RABV-P(以下命名为S179-RABV-P)可以与RIG-I通路中的关键激酶IKKε(I-kappa B kinaseε)结合;区域互作实验表明,S179-RABV-P与IKKε分子的激酶结构域(Kinase domain,KD)和支架二聚化结构域(Scaffold dimerization domain,SDD)均有互作。后续机制研究表明,S179-RABV-P通过与IKKε互作破坏了IKKε/IKKε-KD与上游接头分子TNF受体相关因子3(TNF receptor-associated factor 3,TRAF3)、IKKε/IKKε-KD与下游IRF3的结合,从而抑制IRF3的激活和干扰素的产生。通过反向遗传操作技术将CVS和疫苗株SAD的P蛋白179位点分别突变为Ser和Pro,获得重组突变病毒r CVS-P179S和r SAD-S179P。细胞实验表明,179位点Ser决定了P蛋白在感染细胞中与IKKε互作以及病毒在感染细胞中对IFN和下游干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)激活的抑制能力。小鼠体内实验表明,P蛋白179位点的改变显Oil biosynthesis著影响RABV抑制宿主IFN激活的能力,与亲本株相比,r CVS-P179S攻毒小鼠发病提前,症状加剧;r SAD-S179P在小鼠体内显著致弱,且免疫原性不受影响。对丽沙病毒属中其他成员的P蛋白进行研究发现,丽沙病毒属中的S179-P均可以通过结合IKKε来抑制IRF3激活。综上所述,本研究鉴定了RABV-P的179位点Ser为其拮抗IFN产生的关键位点,S179-RABV-P通过结合IKKε激酶分子扰乱IKKε与TRAF3和IRF3的相互作用,从而抑制IFN反应,且P蛋白179位点Ser的突变可以显著改变病毒的致病性。更重要的是,S179-P通过靶向IKKε拮抗IFN产生这一功能在丽沙病毒属中是保守的。本研究为深入理解丽沙病毒属的免疫逃逸策略与致病机制奠定了基础,同时为RABV减毒活疫苗的研发提供了新的思路。