帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于老年人的,以机体运动功能障碍为典型临床表现的神经退行性疾病,其主要病理改变为黑质致密部A9多巴胺(dopamine,DA)能神经元的进行性变性死亡。PD患者的临床表现随病程而变化,在病程早期患者仅表现为嗅觉减退、睡眠减少、焦虑、抑郁等非运动症状,当黑质出现大量多巴胺能神经元丢失后,患者表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直等运动症状,随着疾病的进一步进展,患者出现姿势不稳、步态障碍、自主神经功能紊乱、吞咽困难、痴呆,最终死亡。目前临床上对PD的发病原因仍处于争论阶段。创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是指外力作用于大脑导致暂时性或永久性结构损伤和功能障碍的疾病,其高发病率、高致残率和高死亡率的特点给社会和家庭带来了严重的负担。研究资料表明,TBI是PD的发病风险因素之一。核因子红系 2 相关因子 2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)是一种细胞抗氧化反应的关键调节因Accessories子。生理情况下,Nrf2定位于细胞浆内,与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH associated protein1)结合形成稳定的复合体,介导Nrf2泛素化从而被蛋白酶体降解。当组织受到氧化应激信号刺激后,Nrf2发生磷酸化与Keap1解耦连,转位进入到细胞核中,与小Maf蛋白等结合成为异二聚体,识别抗氧化反应原件(antioxidant response element,ARE)序列,诱导靶基因表达谷氨酸半胱氨酸催化亚基(Glutamate-Cysteine Ligase Cataytic Subunit,GCLC)、谷氨酸半胱氨酸连接亚基(Glutamate-Cysteine Ligase modifier Subunit,GCLM)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、血红素加氧酶 1(heme oxygenase1,Hmox-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶 1(NAD(P)H:quinine oxidoreductase1.NQO1)等抗氧化和解毒酶,并激活氧化还原调节、炎症反应、细胞凋亡以及线粒体功能等途径,从而发挥保护作用。研究表明,Nrf2在脑损伤和神经退行性疾病中发挥重要作用,但目前尚无文献报道Nrf2在TBI致PD样行为中存在保护作用。在本研究我们应用野生型小鼠通过建立不同伤后时间的TBI慢性期损伤模型探究TBI晚期出现PD样行为的病理生理变化;应用野生型小鼠和Nrf2敲除小鼠构建晚期TBI模型来探究Nrf2丢失在TBI晚期PD样行为的影响;通过富马酸二甲酯灌胃给药方式构建Nrf2过表达小鼠模型,应用野生型小鼠和Nrf2过表达小鼠模型来探究Nrf2过表达对TBI晚期PD样行为的保护作用。方法取12周龄的成年雄性C57BL/6J(WT)小鼠和Nrf2-/-小鼠(18-22g),应用控制性皮质撞击法(controlled cortical impact,CCI)制作中度脑挫伤模型。第一部:将WT小鼠随机分为假手术组(Sham)和创伤性脑损伤组(TBI),并分别于伤后0、1、3、6个月时进行行为学检测,检测后过量吸入异氟烷处死小鼠并取脑组织。运用H&E染色和Nissl染色观察损伤后黑质变化;使用Tunel凋亡试剂盒检测多巴胺能神经元的凋亡情况;应用Western blot和免疫荧光染色检测TBI后不同时间酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况,应用免疫荧光染色检测多巴胺能神经元内α-突触核蛋白(α-syn)和TDP-43的表达情况;应用Western blot和免疫荧光染色检测4-HNE表达情况;应用qPCR检测Nrf2下游基因(Hmox-1,/Nqo1,Gclcand Gclm)的mRNA表达情况;应用ELISA检测试剂盒检测氧化应激变化(测定SOD、MDA水平);应用ELISA和qP更多CR检测炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA表达情况;应用Western blot和免疫荧光染色检测胶质细胞表达变化。第二部分:将WT和Nrf2-/-小鼠分别随机分成假手术组(Sham)和脑挫伤组(TBI)。部分WT小鼠又随机分为溶剂处理组(Veh)和富马酸二甲酯处理组(DMF)。部分WT小鼠于伤后1、7、14天、1个月过量吸入异氟烷处死并取脑组织,另一部分WT小鼠、Nrf2-/-小鼠、Veh组小鼠和DMF组小鼠于伤后6个月进行行为学检测后过量吸入异氟烷处死并取脑组织。应用Western blot和免疫荧光染色检测NRF2的表达随时间的变化规律。应用旷场实验、肌力测试、转棒实验检测小鼠运动能力;应用Tunel凋亡MC3采购试剂盒检测多巴胺能神经元的凋亡情况;应用免疫荧光染色检测多巴胺能神经元内α-syn的表达情况;应用qPCR检测Nrf2下游基因(Hmox-1,/Nqo1)的mRNA表达;应用ELISA检测氧化应激变化(测定SOD、MDA水平);应用ELISA和qPCR检测炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的蛋白和mRNA表达;应用Western blot和免疫荧光染色检测胶质细胞表达变化。结果第一部分:小鼠TBI晚期出现PD样症状,包括抑郁、运动能力减退、平衡能力障碍及步态异常。TBI后小鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡;存活神经元数量进行性减少。α-syn在黑质多巴胺能神经元上沉积进行性增多,TDP-43在伤后6M表达于多巴胺能神经元细胞质中。TBI晚期小鼠黑质区持续存在明显的氧化应激和神经炎症反应。黑质区活化的星形胶质细胞数量和形态学复杂性在伤后3M达到高峰。TBI后小胶质细胞的活化数量和活化程度在伤后6M达到高峰,且小胶质细胞主要向促炎型(M1)方向分化。第二部分:在野生型小鼠中,伤后1、7、14天和1个月时NRF2表达增加,在伤后1、7、14天可见NRF2主要在多巴胺能神经元胞核内表达,且入核比例逐渐减少,在伤后1个月时NRF2在多巴胺能神经元胞质内表达,未见入核。在Nrf2-/-小鼠中,TBI晚期肌力及平衡能力减退;多巴胺能神经元凋亡程度加重;存活神经元的数量明显降低;α-syn在多巴胺能神经元上聚集增多;氧化应激和神经炎症加重;星形胶质细胞活化数量增多,形态学复杂性增高;小胶质细胞的活化程度加深,呈阿米巴样改变。在野生型小鼠中,与溶剂处理组相比,DMF给药小鼠运动能力、肌力和平衡能力改善;神经元凋亡情况减轻;存活神经元数量增多;α-syn在神经元上沉积减少;氧化应激损伤减轻;神经炎症缓解;星形胶质细胞和小胶质细胞活化程度减轻。结论1、TBI晚期小鼠出现PD样行为可能与持续存在的氧化应激和神经炎症导致多巴胺能神经元大量死亡及异常蛋白质沉积相关。2、小鼠TBI后急性期及亚急性期Nrf2通路被激活,慢性期Nrf2通路未被激活。3、NRF2对TBI晚期小鼠出现PD样行为具有神经保护作用,应用DMF可以缓解神经炎症,有效地改善多巴胺能神经元的损伤。