【目的】探讨CD4~+CD25~+Treg细胞在1型糖尿病肾病中的作用及效果,通过小鼠模型开展对照实验,动态观察各组小鼠体内Treg数量及功能的变化,定期监测空腹血糖、体重、24h尿量、饮水量、尿蛋白、胰岛功能及肾脏病理等指标,并对Th1、Th2、Th17、Treg细胞水平进行差异性分析,研究CD4~+CD25~+Treg细胞防治糖尿病肾病的效果,进一步阐明CD4~+CD25~+Treg细胞治疗DN的效果,为DN的免疫细胞治疗提供重要理论依据。【方法】1.将30只8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组(n=6)、T1DM模型组(n=24),T1DM模型组小鼠应用普通饲料喂养联合多次小剂量STZ注射建模,正常对照组以清水及普通饲料喂养。观察小鼠在患病前后症状及体征的变化。2.获取备用正常小鼠脾脏的CD4~+CD25~+Treg,进行体外扩增培养,扩增后的Treg用于治疗T1DM模型组小鼠。根据不同的治疗方案,将T1DM模型组小鼠组细分为T1DM未治疗组(n=6)和Treg低、中、高剂量组,每个剂量组有6只小鼠,分别以(1×10~6/kg、5×10~6/kg、10×10~6/kg)三种浓度治疗对应的小鼠,按拟定时间点检测小鼠空腹血糖、体重、24h尿量、饮水量、尿蛋白、胰岛功能,观察治疗后小鼠各项指标的变化,判断CD4~+CD25~+Treg治疗DN的效果及安全有效剂量。3.按拟定时间点分别获取5组小鼠肾脏切片进行HE染色及PDGF免疫组化检测,观察肾脏病理变化和评估肾脏炎症分数,探究Treg细胞治疗后是否对DN小鼠肾脏有保护作用。4.按拟定时间点分别获取5组小鼠脾脏组织,对脾脏内Th1、Th2、Th17、Treg细胞水平进行差异性分析,进一步探究Treg细胞治疗DN小鼠的分子机制。5.2组将数据比较使用T检验分析,3组及以上使用单因素方差分析。P<0.05为具有统计学差异。【结果】1.各组间空腹血糖(mmol/L)比较:Day14时与正常对照组(5.72±0.24)相比,T1DM组(19.12±0.52)、Treg低剂量组(17.68±0.09)、Treg中剂量组(16.30±0.50)、Treg高剂量组(15.85±0.63)空腹血糖均明显升高,(P<0.001)。Treg高剂量组降糖效果优于Treg中剂量组,与T1DM组比较差异具有统计学意义(P<0.01);Treg中剂量组降糖效果优于Treg低剂量组,与T1DM组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。Treg低剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(5.33±0.23)相比,T1DM组(21.03±1.20)、Treg低剂量组(18.10±1soft tissue infection.35)、Treg中剂量组(16.50±0.38)、Treg高剂量组(15.60±0.62)差异具有统计学意义(P<0.001)。3个治疗组血糖与T1DM组相比仍处于较低水平,Treg高剂量组(P<0.01)和Treg中剂量组(P<0.05)与T1DM组比较差异具有统计学意义,高剂量组控制血糖效果佳。提示Treg可以改善DN小鼠空腹血糖,Day14时疗效显著,Treg浓度越高疗效越明显。2.各组间体重(g)比较:Day14时与正常对照组(21.78±0.310)相比,T1DM组(16.25±0.20)、Treg低剂量组(16.72±0.49)、Treg中剂量组(17.71±0.23)、Treg高剂量组(17.23±0.41)体重均明显降低,(P<0.001)。与T1DM组比较,Treg高剂量组体重下降程度轻,差异具有统计学意义(P<0.05),Treg中低剂量组与与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(21.63±0.46)相比,T1DM组(15.43±0.19)、Treg低剂量组(16.50±0.35)、Treg中剂量组(16.63±0.38)、Treg高剂量组(16.67±0.26)具有统计学意义(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示Treg可以改善DN小鼠体重减轻症状,Day14时疗效显著,且Treg浓度越高疗效越明显。3.各组间24h尿量(ml)比较:Day14时与正常对照组(0.09±0.01)相比,T1DM组(1.66±0.17)、Treg低剂量组(1.13±0.12)、Treg中剂量组(1.13±0.07)、Treg高剂量组(0.97±0.04)尿量水平均明显升高,(P<0.001)。与T1DM组比较,Treg中剂量组(P<0.05),高剂量组(P<0.01)24h尿量水平改善明显,Treg低剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(0.08±0.02)相比,T1DM组(1.25±0.15)、Treg低剂量组(1.22±0.06)、Treg中剂量组(1.02±0.09)、Treg高剂量组(0.95±0.03)差异具有统计学意义(P<0.001),Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示Treg可以改善DN小鼠多尿症状,Day14时疗效显著,且Treg浓度越高疗效越明显。4.各组间24h饮水量(ml)比较:Day14时与正常对照组(5.33±0.33)相比,T1DM组(27.17±2.02)、Treg低剂量组(23.17±1.64)、Treg中剂量组(23.33±2.20)、Treg高剂量组(20.67±1.38)24h饮水量均明显增加,(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(5.00±0.58)相比,T1DM组(26.00±2.52)、Treg低剂量组(22.00±1.15)、Treg中剂量组(18.00±1.53)、Treg高剂量组(15.67±0.88)差异具有统计学意义(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时中高剂量组小鼠平均饮水量较Day14时有所减少,提示Treg可能改善DN小鼠多饮症状。5.各组间24h尿蛋白(mg)比较:Day14时与正常对照组(0.04±0.01)相比,T1DM组(0.65±0.04)、Treg低剂量组(0.58±0.05)、Treg中剂量组(0.50±0.03)、Treg高剂量组(0.44±0.02)尿蛋白水平均明显升高,(P<0.001)。与T1DM组比较,Treg中剂量组(P<0.05),高剂量组(P<0.01)尿蛋白下降明显,Treg低剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(0.03±0.01)相比,T1DM组(0.60±0.03)、Treg低剂量组(0.56±0.02)、Treg中剂量组(0.48±0.05)、Treg高剂量组(0.43±0.04)差异具有统计学意义(P<0.001)。Treg高剂量组与BMN 673浓度T1DM组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示Treg可以改善DN小鼠蛋白尿症状,且Treg浓度越高疗效越明显。6.各组间胰岛素浓度(n IU/ml)比较:Day14时与正常对照组(62.73±4.47)相比,T1DM组(19.47±1.18)、Treg低剂量组(20.05±1.84)、Treg中剂量组(21.78±1.59)、Treg高剂量组(28.94±1.95)胰岛素水平均明显下调,(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(63.28±4.01)相比,T1DM组(22.06±1.50)、Treg低剂量组(25.40±1.99)、Treg中剂量组(29.08±1.11)、Treg高剂量组(36.21±1.52)差异具有统计学意义(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时中高剂量组小鼠平均胰岛素水平较Day14时有所回升,提示Treg可能改善DN小鼠胰岛素水平。7.各组间C肽浓度(ng/ml)比较:Belnacasan纯度Day14时与正常对照组(13.25±0.71)相比,T1DM组(6.27±0.44)、Treg低剂量组(6.42±0.48)、Treg中剂量组(7.80±0.36)、Treg高剂量组(8.50±0.15)C肽水平均明显下调,(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(13.38±0.23)相比,T1DM组(6.46±0.06)、Treg低剂量组(7.37±0.39)、Treg中剂量组(8.94±0.37)、Treg高剂量组(10.56±0.70)差异具有统计学意义(P<0.001)。Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时中高剂量组小鼠平均C肽水平较Day14时有所回升,提示Treg可能改善DN小鼠C肽水平。8.各组间肾脏HE染色病理切片比较:对照组小鼠的肾组织形态结构正常,无明显病变。T1DM组小鼠肾小管出现扩张、肾小管上皮细胞存在空泡变性、肾间质伴有水肿,存在中等量肾小管颗粒样变性,伴随肾小球基膜增厚。随着造模时间增加,肾组织病变越重。Treg治疗后,肾组织病变相对有所减轻:Treg低剂量组病变情况较T1DM组轻,存在少量肾小管颗粒样变性,中剂量组病变比低剂量组轻,高剂组肾脏恢复情况优于其余两个治疗组,仅存在微量肾小管颗粒样变性,病变情况与对照组接近。提示Treg可以改善DN小鼠肾脏炎性病变程度,且Treg浓度越高疗效越明显。9.各组间肾脏PDGF表达水平比较:对照组小鼠肾组织中仅含极少量的棕褐色颗粒,着色十分浅淡;与对照组小鼠相比,T1DM组小鼠肾组织的PDGF表达明显升高,观察肾组织可发现大量棕褐色颗粒沉积,随着造模时间增加,肾组织PDGF表达增多。Treg治疗组同T1DM组相比,肾组织的PDGF的表达有所减轻,表达程度依次为:低剂量组>中剂量组>高剂量组。提示Treg可以降低DN小鼠肾脏PDGF表达水平,且Treg浓度越高疗效越明显。10.各组间肾脏病理评分比较:Day14时与正常对照组(0.00±0.00)相比,T1DM组(3.00±1.00)、Treg低剂量组(2.67±0.58)、Treg中剂量组(2.33±0.58)、Treg高剂量组(1.33±0.58)炎症评分均有增加,差异具有统计学意义,其中T1DM组(t=5.133,P<0.01),Treg低剂量组(t=4.399,P<0.01),Treg中剂量组(t=4.033,P<0.05),各组出现不同程度的肾脏炎性病变,结合切片结果,评分依次是T1DM组>Treg低剂量组>Treg中剂量组>Treg高剂量组。但Treg低剂量组、中剂量组、高剂量组与T1DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Day34时与正常对照组(0.00±0.00)相比,T1DM组(3.33±0.58)、Treg低剂量组(3.00±1.00)、Treg中剂量组(2.33±0.58)、Treg高剂量组(1.67±0.58),其中T1DM组(t=5.105,P<0.001),Treg低剂量组(t=4.741,P<0.01),Treg中剂量组(t=4.376,P<0.05),Treg低剂量组和Treg中剂量组肾脏病变有所减轻,Treg高剂量组与对照组病变情况接近,差异无统计学意义。提示Treg可以减轻DN小鼠肾脏病理改变,且Treg浓度越高疗效越明显。11.各组间脾脏免疫细胞比较:建模成功当天,5组小鼠脾细胞内Th1、Th2、Th17、Treg水平暂无明显差异。经过Treg治疗后,Day14时T1DM组小鼠的Th1、Th2、Th17水平下调,Treg水平上升,与正常对照组比较,Th1(P<0.001),Th2(P<0.05)差异具有统计学意义,但Th17和Treg与正常对照组比较差异无统计学意义。Day14时Treg低剂量组提升Th2细胞水平效果最好,Treg中剂量组提升Treg水平效果最好。但3个治疗组对Th1细胞影响无规律,对Th17细胞的影响各组间未见明显差异。Day34时,5组小鼠脾细胞内Th1、Th2、Th17、Treg水平无明显差异。【结论】1.CD4~+CD25~+Treg细胞可能在一定程度上改善DN小鼠的空腹血糖、体重、24h尿量、饮水量、尿蛋白以及胰岛素和C肽水平。2.CD4~+CD25~+Treg细胞在DN中具有改善肾脏炎性病变的作用,高剂量组疗效明显,可能与提高肾脏组织中Treg细胞的数量有关。3.Th1、Th2、Th17、Treg水平在T1DM中存在比例失衡,不同浓度CD4~+CD25~+Treg细胞治疗后,Day14时中剂量组提升Treg水平效果最好,低剂量组提升Th2细胞水平效果最好。但Treg对Th1水平影响无规律,各组间Th17水平未见明显差异。