目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是仅次阿尔茨海默病的一种神经系统退行性疾病,常见于60岁左右老年人。PD起病大多较隐匿,进展缓慢,当出现动作缓慢、僵硬和震颤等运动功能损害时已是病理晚期。其主要的病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡,伴随纹状体多巴胺含量明显减少,但其原因和具体机制尚不明确。最近的报道显示,过量的脂肪酸(Fatty acid,FA)会导致神经元细胞脂质过氧化、氧化应激、线粒体解偶联和功能障碍,参与了PD的病理变化。因此精细控制和及时消除神经元细胞中的游离FA对于防止PD相关的神经退行性变至关重要。星形胶质细胞是中枢神经系统中最常见的细胞类型,也是主要的免疫和反应细胞。反应性星形胶质细胞能释放多种分子,加剧炎症并影响神经元Belumosudil配制细胞的功能。小细胞外囊泡(Small extracellular vesicles,s EVs)是由细胞产生并释放具有Barasertib膜结构的小囊泡,能够介导细胞之间的通讯,其中携带的微RNA(micro RNA,miRNA)已被证明与PD相关。最近研究发现,miR-543-3p在MPP~+处理的星形胶质细胞中高表达,调控谷氨酸转运体造成运动功能障碍,提示其可能参与了PD的发生发展。我们前期研究发现PD反应性星形胶质细胞释放的s EVs中miR-543-3p高表达。星形胶质细胞是否通过s EVs中的miR-543-3p影响神经元细胞死亡。我们通过生物信息学分析发现沉默调节蛋白1(Silent information regulator 1,Sirt1)是miR-543-3p的靶基因。研究表明,Sirt1可以调节脂质代谢和自噬,调节神经元细胞的凋亡来减轻神经退行性疾病造成的损伤。基于以上研究,我们提出假设:PD反应性星形胶质细胞释放的小细胞外囊泡通过miR-543-3p/Sirt1介导脂肪酸储留导致神经元凋亡。方法:1.利用MPP~+处理获得反应性星形胶质细胞,然后通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链式反应分别验证反应性星形胶质细胞标志物蛋白和miR-543-3p的表达情况。2.使用超滤加超速离心分离星形胶质细胞培养上清的小细胞外囊泡,通过纳米流式检测仪、透射电子显微镜和蛋白免疫印迹对小细胞外囊泡进行鉴定,实时荧光定量聚合酶链式反应检测miR-543-3p在小细胞外囊泡中的表达情况。3.建立星形胶质细胞和神经元细胞的共培养体系,通过免疫荧光和实时荧光定量聚合酶链式反应验证星形胶质细胞的miR-543-3p能够经过小细胞外囊泡传递至神经元细胞。4.检测星形胶质细胞小细胞外囊泡处理后的神经元细胞活性,使用蛋白免疫印迹检测神经元细胞的凋亡情况。再利用共培养和miR-543-3p mimics验证神经元细胞的凋亡。5.使用生物信息学分析对miR-543-3p的靶基因进行预测,并对它们进行功能富集分析。6.检测星形胶质细胞小细胞外囊泡处理后的神经元细胞内脂肪酸含量,再检测神经元细胞脂质过氧化程度,通过免疫荧光观察脂滴,蛋白免疫印迹检测氧化应激和线粒体功能。7.利用miR-543-3p mimics和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)探究miR-543-3p导致神经元细胞脂肪酸储留的具体机制。8.利用si Sirt1敲低神经元细胞的蛋白表达,通过免疫荧光和蛋白免疫印迹验证Sirt1的功能。9.通过实时荧光定量physical and rehabilitation medicine聚合酶链式反应、蛋白免疫印迹和双荧光素酶基因检测验证miR-543-3p的靶基因。结果:1.miR-543-3p在使用MPP~+激活后的反应性星形胶质细胞中表达升高,差异具有统计学意义(P=0.0004)。2.纳米流式检测仪检测小细胞外囊泡粒径分布在50～200 nm;透射电子显微镜下小细胞外囊泡呈杯口状;蛋白免疫印迹检测小细胞外囊泡三个阳性蛋白标志物ALIX、TSG101和CD9为阳性,阴性蛋白标志物GM130为阴性。3.实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫荧光观察到miR-543-3p通过小细胞外囊泡从星形胶质细胞转移到神经元细胞内。4.细胞活性和蛋白免疫印迹结果显示,MPP~+刺激的星形胶质细胞小细胞外囊泡通过miR-543-3p诱导神经元细胞凋亡。5.miR-543-3p的靶基因在调节脂肪酸转运处富集,其脂肪酸毒性可能导致神经元的凋亡。6.MPP~+刺激的星形胶质细胞小细胞外囊泡通过miR-543-3p介导脂肪酸储留导致神经元细胞发生脂质过氧化、氧化应激和线粒体损伤。其具体机制是miR-543-3p通过小细胞外囊泡在神经元细胞中高表达,影响了脂肪酸向胞外转运,导致其产生了脂肪酸毒性。7.miR-543-3p通过小细胞外囊泡靶向Sirt1调控脂肪酸转运导致其在神经元细胞内储留。结论:1.miR-543-3p在MPP~+刺激的星形胶质细胞和其分泌的小细胞外囊泡中高表达。2.MPP~+刺激的星形胶质细胞通过小细胞外囊泡miR-543-3p诱导神经元凋亡。3.MPP~+刺激的星形胶质细胞通过小细胞外囊泡miR-543-3p介导神经元脂肪酸储留导致脂质过氧化、氧化应激和线粒体损伤。4.miR-543-3p通过小细胞外囊泡靶向Sirt1介导神经元脂肪酸转运功能障碍导致脂肪酸毒性产生。