研究背景2型心肾综合征(cardiorenal syndrome,CRS)是指慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)患者出现进行性肾功能不全。流行病学调查显示CHF患者中约25%-40%伴有慢性肾功能不全,23%罹患进行性肾功能损伤,使CHF病死率显著增加,严重影响了人们的生命健康,同时也带来了巨大的经济负担。由于其发病原因和机制比较复杂,目前缺少准确且灵敏的检测指标,因此治疗措施及疗效也非常有限。目前研究发现CHF患者体内长期处于微炎症状态,促使肾小球及肾间质募集大量白细胞及纤维生成细胞,与激活的肾组织内固有免疫细胞共同作用,生成大量炎性因子,造成肾小球滤过屏障及重吸收功能受损,最终形成蛋白尿,导致肾功能的损伤。除此之外,2型CRS患者由于循环障碍、贫血等原因,机体常处于慢性缺氧状态,因此代谢活性高、氧需求大的肾小管上皮细胞极易受到缺氧损伤。慢性缺氧与炎性反应相互促进,导致肾组织中的成纤维型细胞增殖以及促纤维分子如胶原蛋白、纤维蛋白的转录,直接和间接引起肾纤维化。中医药具有多靶点、多环节、多因素的特点,在该疾病的治疗上发挥了重要作用,因此成为寻找治疗2型CRS新途径的主要领域。研究目的1通过构建CHF并发慢性肾功能不全的临床预测模型,探索2型CRS发生发展的独立危险因素,以便能够及时识别并干预CHF后早期肾损伤,延缓为2型CRS的病理进程;2通过网络药理学对真武汤的有效成分进行分析,预测其治疗2型CRS的Programmed ventricular stimulation靶点和通路,为下一步进行机制探索提供一定的思路和方法;3从炎症和缺氧两方面入手,探索真武汤上调miR-451的表达,抑制TLR4/NF-κB/HIF-1α环路介导的肾纤维化,延缓2型CRS病理进程的分子机制。研究方法1慢性心力衰竭并发2型CRS的相关危险因素分析纳入中国中医科学院广安门医院综合科CHF的住院患者共254例,根据是否发生肾功能损伤分为154例CHF患者和100例2型CRS患者。详细记录临床资料,包括基本临床资料及检查检验指标等,通过单因素分析和Logistic回归分析CHF合并慢性肾功能不全的危险因素,然后构建Nomogram图,并通过校准曲线、ROC曲线和决策曲线对模型进行评估。另外还运用相关性分析进行了证型相关性分析,发现阳虚证是2型CRS发生的关键证型。2基于网络药理学探讨真武汤治疗2型CRS作用机制的研究通过TCMSP数据库并结合文献查找真武汤各味中药的活性成分和药物潜在靶点;在 OMIM、GeneCards、PharmGkb 数据库中以“Type 2 cardio-renal syndrome”等为关键词搜索2型CRS的相关靶点,绘制中药化学成分靶点与2型CRS靶点的韦恩图。将共同靶点导入STRING数据库中构建靶点相互作用网络图,利用Cytoscape软件进行可视化处理,筛选出核心靶点。使用R数据库对靶点进行GO和KEGG富集分析。3真武汤对2型CRS大鼠肾纤维化改善作用的研究3.1采用8周龄SD大鼠进行实验,通过冠状动脉左前降支结扎术加3/4肾切除术构建2型CRS大鼠模型,随机分为健康组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(Model)、VX-765体内卡托普利组(Captopril)、真武汤低剂量组(ZWT-L)、真武汤中剂量组(ZWT-M)和真武汤高剂量组(ZWT-H)。Control组、Sham组及Model组用等容积蒸馏水进行干预,其余组用相应的药物进行干预,共干预4周。每周进行体重检测,在给药0周、4周留取血液及24小时尿液标本,后续进行Scr、BUN、NT-proBNP和24小时尿蛋白定量检测。3.2大鼠心脏超声检测:干预后的所有大鼠分别于手术后和药物治疗4周后进行心脏超声检测,采用HP5500彩色多普勒超声显像仪分别进行LVIDD、LVIDS、HR、CO、EF和FS等指标的检测。3.3大鼠肾脏形态学检测:主要采用HE染色、Masson染色及PASM染色对肾脏组织结构及纤维化程度进行检测,并通过imagej软件对纤维化和间质改变的程度进行评估。3.4采用实时荧光定量(qPCR)检测肾脏miR-451基因的表达,qPCR和免疫组织化学检测TLR4、IκBα蛋白和基因的表达,qPCR、组织免疫组织化学及免疫荧光检测NF-κB、HIF-lα蛋白和基因的表达。3.5 采用 qPCR 和 Western Blot 检测肾脏组织中 MCP-1、ICAM-1、IL-6 和IL-1β蛋白和基因的表达,Elisa检测各组大鼠血清IL-1β和IL-6的表达。3.6 采用 qPCR 和 Western Blot 检测肾脏组织中 TGF-β1、Smad2、Smad3、FN、α-SMA 和 E-cadherin 的表达,qPCR 检测 PAI-1、CTGF、COL Ⅰ 和 COL Ⅳ等基因的表达。研究结果1慢性心力衰竭并发2型CRS的相关危险因素分析1.1通过单因素分析和Logistic回归分析CHF合并慢性肾功能不全的危险因素,发现GIGU、URBP、H-CRP、LA是CHF发展为2型CRS的独立危险因素(P<0.05)。以上述危险因素作为变量,构建nomogram图。采用校准曲线和ROC曲线进行评估,发现训练集ROC曲线下面积为0.895(95%CI:0.750,0.878),验证集ROC曲线下面积为0.845(0.816,0.824),预测价值较高;校准图看出训练集和验证集校准曲线与标准曲线较为接近,说明实际预测值和nomogram图的预测值呈现一致性,拟合度较好。使用决策曲线分析评估对患者的收益性,发现nomogram图具有正净效益性,并且有广泛的阈值概率范围性。1.2进一步通过证型分析发现,阳虚证在2型CRS患者中的分布明显高于CHF组(P<0.05),且与气虚证、血虚证和阴虚证具有明显的相关性。通过对阳虚证和非阳虚证的2型CRS患者进行比较发现,在肾功能方面,阳虚证患者BUN、Cr、TRU、MA及URBP等指标明显高于非阳虚证患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。在心功能方面,与非阳虚证患者相比,阳虚证患者NT-proBNP、LVEDD、CTNI和心功能分级(NYHA分级)属于Ⅲ、Ⅳ级的明显升高,FS明显减低,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明阳虚证是CHF向2型CRS发展过程中起关键作用的证型。2基于网络药理学探讨真武汤治疗2型CRS作用机制的研究基于网络药理学研究共发现共得到真武汤的28个有效成分及282个潜在作用靶点,通过与疾病靶点取交集共发现165个真武汤作用于2型CRS的靶点,构建PPI网络共发现RXRA、ESR1、JUN、NCOA1及AKT1等5个关键靶点,通过富集分析发现其主要通过Toll样受体、IL-17、TNF、NF-κB等信号通路发挥作用,这些靶点和通路主要与炎症反应、氧化应激等机制有关。3真武汤对2型CRS大鼠肾纤维化改善作用的研究3.1真武汤对2型CRS大鼠心肾功能的影响血清及尿液指标显示,Control组和Sham组Scr、BUN、NT-proBNP和24小时尿蛋白定量未见明显差异(P>0.05);与Sham组相比,Model组上述指标均有显著升高(P<0.01);真武汤能够显著降低大鼠的Scr、BUN、NT-proBNP和24小时尿蛋白定量的水平(P<0.01),且ZWT-M组和ZWT-H组Scr、BUN、NT-proBNP下降更明显(P<0.05)。心脏超声结果显示,真武汤干预后大鼠LVIDS的水平明显下降,CO、EF和FS均有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);各组而LVIDD、HR水平未见明显改变(P>0.05)。3.2真武汤对2型CRS大鼠肾脏病理改变的影响HE染色结果显示:真武汤可改善2型CRS大鼠肾脏的组织形态,是肾小球结构趋于正常,肾间质纤维化程度减轻,炎症细胞浸润减少,肾小管肿胀减轻。Masson染色发现:真武汤组肾小球及肾间质中纤维化的面积均有不同程度的减少,差异具有统计学意义(P<0.05);PASM染色结果显示:真武汤能使肾小管扩张减轻,肾小球及肾小管基底膜增厚均有所减轻,系膜基质增生好转。通过阳性率比较发现,用药各组PASM染色阳性率较模型组明显改善(P<0.01),但用药各组之间未见明显差异(P>0.05)。3.3真武汤对2型CRS大鼠肾脏miR-451及TLR4/NF-κB/HIF-1 α环路表达的影响qPCR结果显示,Control组和Sham组肾脏组织中miR-451基因mRNA的含量未见明显差异;与Sham组相比,Model组miR-451基因mRNA的含量明显下降(P<0.01);与Model组相比,Captopril组、ZWT-L组和ZWT-H组肾脏组织中miR-451基因mRNA的含量显著增多(P<0.01),ZWT-M组miR-451基因mRNA的含量未见明显改变(P>0.05)。qPCR和免疫组化结果显示:Control组和Sham组肾脏组织中TLR4、IκBα、NF-κB及HIF-1蛋白及mRNA的表达未见明显差异(P>0.05);与Sham组相比,Model组上述蛋白及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05);与 Model 组相比,真武汤干预后 TLR4、IκBα、NF-κB 及 HIF-1α mRNA表达明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果也显示:真武汤可以显著降低肾组织中NF-κB及HIF-lα的表达。3.4真武汤对2型CRS大鼠肾脏相关炎性因子的影响qPCR 和 Western blot 结果显示:Control组和 Sham 组 MCP-1、ICAM-1、IL-1β及IL-6蛋白及mRNA的表达未见明显差异(P>0.05)。与Sham组相比,Model组上述炎症因子的蛋白及mRNA的表达明显升Q-VD-Oph化学结构高(P<0.01)。与Model组相比,用药各组上述炎症相关蛋白和mRNA的表达有不同程度的下降。Elisa的结果也证实真武汤可以显著降低大鼠血清中IL-6和IL-1β的表达(P<0.01)。3.5真武汤对肾纤维化相关通路标志分子表达的影响qPCR和Western Blot检测发现:Control组和Sham组肾脏组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、FN、α-SMA和E-cadherin蛋白及mRNA的表达未见明显差异;与Sham组相比,Model组TGF-β1、Smad2、Smad3、FN、α-SMA和E-cadherin蛋白及mRNA的表达明显增加(P<0.05)。与Model组相比,真武汤能够不同程度的抑制 TGF-β1、Smad2、Smad3、FN、α-SMA 和 E-cadherinmRNA 的表达。qPCR结果分析发现:Control组和Sham组肾脏组织中PAI-1、CTGF、COLⅠ和COL Ⅳ基因mRNA的表达未见明显差异;与Sham组相比,Model组PAI-1、CTGF、COLⅠ和COL Ⅳ基因mRNA的表达明显增加(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.01)。与Model组相比,真武汤能够不同程度的抑制PAI-1、CTGF、COL Ⅰ和COL Ⅳ的表达。研究结论1通过单因素分析和Logistic回归分析CHF合并慢性肾功能不全的危险因素,发现GIGU、URBP、H-CRP、LA是CHF发展为2型CRS发生的独立危险因素,将这些因素作为变量构建临床预测模型并进行验证发现,该模型预测价值较高、拟合度较好且有广泛的阈值概率范围性。2阳虚证在2型CRS患者中的分布明显高于CHF组,且与气虚证、血虚证和阴虚证具有明显的相关性,且阳虚证的2型CRS患者心肾功能更差,说明阳虚证是CHF向2型CRS发展过程中起关键作用的证型。3网络药理学研究发现,RXRA、ESR1、JUN、NCOA1及AKT1是真武汤治疗2型CRS的5个关键靶点,Toll样受体、IL-17、TNF、NF-κB等是发挥作用的主要通路和途径。4真武汤能够降低2型CRS大鼠Scr、BUN、NT-proBNP和24小时尿蛋白定量的表达,从而改善心肾功能;能够通过升高LVEF、FS、CO,降低LVIDS延缓心室重构的进程,改善心脏泵血功能,进而减少肾功能损伤的发生;能够减轻2型CRS大鼠肾脏病理结构,使肾小球结构趋于正常,肾间质纤维化程度减轻,炎症细胞浸润减少,肾小管肿胀减轻,基底膜增厚有所减轻,系膜基质增生好转。5真武汤能够上调肾脏组织中miR-451的表达,下调TLR4、NF-κB、HIF-1α蛋白和基因的表达,抑制TLR4/NF-κB/HIF-1 α反应环路,进而抑制MCP-1、ICAM-1、IL-1β及IL-6 等炎症因子及TGF-β1、Smad2、Smad3、FN、α-SMA、E-cadherin、PAI-1、CTGF、COL Ⅰ和COL Ⅳ等纤维化相关因子的表达,改善肾纤维化,延缓2型CRS的病理进程。