奶牛乳腺炎是奶牛最常见的感染性疾病之一,会对奶牛的生产性能造成严重的影响,导致乳业蒙受大量生产损失。在奶牛乳腺组织中,奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)是抵抗病原微生物的第一道防线。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原微生物之一,其细胞壁的主要成分脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)可引起炎症及氧化应激反应。世界各国普遍优先选用抗生素类药物治疗奶牛乳腺炎,但是,抗生素的过度使用会引起细菌产生耐药性以及乳汁抗生素残留问题,严重危害消费者的健康。中药活性成分毒性低、无残Bafilomycin A1化学结构留、不易产生耐药性,在奶牛乳腺炎的防治中受到广泛的关注。儿茶素(Catechin,C)作为茶叶中含量最高、研究最广泛的茶多酚成分,具有控制炎症和减少氧化应激的功效,然而,儿茶素对LTA诱导的乳腺炎及调控机制仍有待阐明。本研究旨在通过体内和体外试验结合的方式,探究儿茶素能否改善由LTA诱发的乳腺炎症和氧化应激反应并分析其可能的分子机制,以确认儿茶素对LTA诱导奶牛乳腺炎的治疗效果,为乳腺炎的临床用药提供参考和依据。试验一:MAC-T细胞体外炎症与氧化应激模型的建立为确保后续试验顺利进行,首先需要确定LTA的最佳致炎浓度。本试验设置空白对照组(CG组)、炎症模型组(LTA组)。CCK-8检测细胞活力LTA浓度>20μg/mL时对MAC-T细胞产生显著影响(P<0.05)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表达,结果表明促炎因子表达量分别提高1.3倍、1.3倍、7.2倍。活性氧(ROS)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒和抗氧化酶检测试剂盒进一步检测LTA诱导MAC-T细胞后氧化应激指标表达水平,试验结果显示:ROS、MDA大量产生,ROS表达量提高9.5倍,MDA含量由1.19 nmol/mg升高至4.62 nmol/mg,提高3.9倍表达水平,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)DS-3201两种氧化酶被显著抑制(P<0.05)。根据试验结果,本试验选择用20μg/mL的LTA浓度构建体外模型。试验二:儿茶素Infected wounds缓解LTA诱导的MAC-T细胞炎症和氧化应激机制研究为探究儿茶素对LTA诱导的MAC-T细胞是否具有缓解作用,首先采用CCK-8法测定儿茶素作用MAC-T细胞后的安全浓度,结果显示,80μg/mL的儿茶素作用细胞后显著影响细胞活力(P<0.05),因此本试验设置空白对照组(CG组)、炎症模型组(LTA组)、D1组(LTA+20μg/mL儿茶素)、D2组(LTA+40μg/mL儿茶素)进行后续试验。RT-qPCR法检测儿茶素对炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的抑制作用,结果表明儿茶素降低了LTA诱导的MAC-T细胞中炎性因子水平,40μg/mL剂量组抑制效果理想。蛋白质印迹法(Western blot)等方法检测儿茶素对LTA诱导MAC-T细胞后TLR2及下游NF-κB、MAPK通路的表达,并检测炎性因子和Nrf2抗氧化通路的表达。结果显示,与LTA组相比,儿茶素能抑制TLR2的表达,抑制MAPK信号通路中p38、ERK和JNK的磷酸化水平;抑制NF-κB信号通路中p65、IκBA的磷酸化水平,抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。儿茶素可促进Nrf2及HO-1、NQO1、SOD、CAT等抗氧化酶的表达,减少ROS和MDA的积累。本试验结果表明,儿茶素可缓解LTA诱导的MAC-T细胞炎症与氧化应激反应。试验三:小鼠模型验证儿茶素对乳腺炎症与氧化应激反应的调控作用奶牛作为一种大型经济动物,其经济成本过高,在实际应用和操作中不方便,本试验采用小鼠为实验动物开展试验。设置空白对照组、炎症模型组(LTA组)、低(LTA+10 mg/kg儿茶素)、中(LTA+20 mg/kg儿茶素)、高(LTA+30 mg/kg儿茶素)剂量组和地塞米松(LTA+5 mg/kg)治疗组。LTA致炎后小鼠体重平均下降约6.5 g,LTA+20 mg/kg儿茶素治疗组平均体重下降约3.6 g,活检乳腺组织LTA组可见明显乳腺结节,血管紧张红肿症状,不同浓度儿茶素处理后病理反应有所缓解。H&E染色结果表明,LTA致炎后腺泡密集增生、细胞脱落坏死、中性粒细胞浸润等,不同浓度的儿茶素处理后与LTA致炎组相比腺泡增生减少、胞质轻度浸润。Western blot法和RT-qPCR结果显示:LTA诱导小鼠乳腺组织后可识别TLR2受体,激活MAPK、NF-κB信号通路,增加TNF-α、IL-1β、IL-6的释放;不同浓度儿茶素处理后促进Nrf2蛋白表达,增加下游抗氧化基因,抑制MAPK、NF-κB信号通路的活化,减少促炎因子的释放。本试验结果表明,儿茶素可缓解小鼠乳腺炎的炎症与氧化应激反应。综合上述结果,儿茶素可通过抑制TLR2介导的MAPK通路和NF-κB通路调控MAC-T细胞和小鼠乳腺炎症反应,上调Nrf2蛋白表达,增加HO-1、NQO1、SOD、CAT等抗氧化酶活性,减少MAC-T细胞和小鼠乳腺组织的氧化应激损伤。本研究结果为全面揭示儿茶素的抗炎机制以及在奶牛乳腺炎防治中的应用提供了新的依据。