研究背景和目的:胃癌(Gastric cancer,GC)是全球常见的恶性肿瘤之一。胃癌的发生与遗传、环境、生活方式等多种因素有关。其发病率在全球范围内都较高,特别是在亚洲地区,胃癌的发病率更是居高不下。目前,手术、化疗和放疗仍然是治疗胃癌的重要方法,但这些方法对于晚期胃癌的治疗效果不佳。因此,寻找新的治疗策略对于胃癌的治疗至关重要。随着分子生物学和基因组学等技术的不断发展,越来越多的肿瘤靶向治疗和免疫治疗策略被发现,为胃癌的治疗带来了新的希望。值得注意的是,胃癌的分子亚型具有巨大的异质性,因selleck LGK-974此了解胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的预防、诊断和治疗至关重要。FOXM1(Forkhead box M1)是一种典型的增殖相关转录因子,属于叉头盒蛋白超家族。在人类基因组中,FOXM1基因位于染色体12p13-3末端着丝粒区域,全长约25kb,包含10个外显子。目前已经确定了四种FOXM1亚型:其中FOXM1a具有抑制作用,而FOXM1b和FOXM1c则是转录激活因子。细胞质中的FOXM1d不直接参与转录调控。值得注意的是,在这些亚型中,FOXM1b表现出最高的转录活性。作为一种重要的转录因子,FOXM1能够调节细胞周期G/S和G2/M过渡以及有丝分裂进展等关键生物学过程。同时它也受到Hedgehog、p53、Ras信号通路的调控,并激活下游靶点如细胞周期蛋白B1(CCNB1)。此外,FOXM1已在人类中被确认为原癌基因,其过表达与Hedgehog信号通路介导的基底细胞癌发生有关。FOXM1还可以协同CENPF促进前列腺癌进展,并且它们的共同表达是生存期短和易转移的不良指标。除了发挥转录因子作用之外,FOXM1还可以通过与其他蛋白如β-catenin或SMAD3相互作用,通过Wnt或TGF-β信号通路发挥致癌作用。hTERT(Human telomerase rselleck NMReverse transcriptase)是端粒酶的催化亚基,能够调节端粒酶活性并维持端粒的完整性。在人类结肠癌、淋巴瘤和骨髓瘤细胞中发现h TERT活性增加,这是对辐射诱导的DNA损伤的一种修复反应。在胃癌细胞中h TERT的上调可以抑制mi R-29a的表达并增强整合素亚基β1(Integrin subunit beta 1,ITGB1)的表达,显著增加胃癌细胞侵袭和转移的能力。而长链非编码RNA(lnc RNAs)BC032469通过上调h TERT表达,促进胃癌细胞增殖。因此,了解调控h TERT的分子机制非常重要。许多对h TERT调控机制的研究都集中在转录水平上,而翻译后修饰水平的调控,如泛素化的调节,尚未得到彻底探索。研究方法:1.利用TCGA泛癌数据集分析34种癌症和对应正常组织中FOXM1和h TERT的表达水平。在仙桃学术平台(https://www.xiantao.love/)对FOXM1和h TERT共同上调的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。2.利用体外泛素化实验检测过表达野生型或突变型(转录活性位点突变)或截短型FOXM1(N端缺失、DBD缺失和C端缺失)后,h TERT的泛素化降解情况。3.采用双萤光素酶实验分析在HEK293T细胞中过表达野生型或突变型FOXM1后对p GL4.26-6×DB报告质粒和p GL3-CCNB1启动子的活性影响。4.通过免疫共沉淀实验检测野生型或突变型FOXM1对MKRN1-h TERT或MDM2-h TERT结合的影响。5.通过集落形成实验探究h TERT敲低对突变型FOXM1促进细胞增殖的影响以及突变型FOXM1的DBD区域缺失对胃癌细胞增殖能力的影响。6.利用多重荧光免疫组化(Multiplex immunohistochemistry,m IHC)技术对胃癌组织芯片中的FOXM1和h TERT进行ROC曲线和生存分析。结果:1.与正常组织相比,FOXM1在33种癌症中显著上调,而h TERT在29种癌症中显著上调。韦恩图显示,有30个差异表达基因在FOXM1组和h TERT组中同时上调。接着对这30个差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析,结果显示FOXM1和h TERT共同上调基因参与细胞周期和减数分裂过程。2.过表达野生型FOXM1显著抑制h TERT的泛素化降解。FOXM1转录活性突变后和野生型一样,仍然能明显减少h TERT的泛素化降解,这说明FOXM1非转录依赖下调h TERT的泛素化水平并增加其蛋白稳定性。此外,FOXM1的DBD段缺失后h TERT的泛素化水平显著增加,促进了其蛋白降解,这意味着FOXM1通过其DBD区域与h TERT相互作用,抑制h TERT的泛素化降解。3.FOXM1-Mut与FOXM1-WT相比,p GL4.26-6x DB报告质粒的转录活性明显减弱。此外,FOXM1靶基因CCNB1的启动子活性也被FOXM1-Mut抑制,说明该转录活性突变体构建成功。4.过表达野生型FOXM1和突变型FOXM1不影响MDM2和h TERT之间的相互作用,但阻止了MKRN1与h TERT蛋白的结合。5.我们发现FOXM1-Mut促进胃癌细胞的集落形成,敲低h TERT显著减弱了FOXM1-Mut的增殖能力。FOXM1 DBD区域的缺失破坏了FOXM1-h TERT相互作用,从而降低了细胞增殖和克隆形成能力。6.在90例胃癌患者中,ROC曲线提示FOXM1和h TERT均能有效预测胃癌患者的预后。此外,生存分析显示FOXM1或h TERT高表达与胃癌患者预后不良相关。重要的是,FOXM1和h TERT同时高表达提示预后最差,而同时低表达提示预后最好。结论:综上所述,我们的研究结果建立了胃癌中两个重要致癌基因之间的新联系。FOXM1可以通过阻碍E3连接酶MKRN1和h TERT结合抑制h TERT的降解,来非转录依赖地增加h TERT蛋白水平。FOXM1和h TERT在人胃癌样本中均有升高,两者同时上调预示预后不良。值得注意的是,尽管FOXM1和h TERT都被证明可以激活Wnt/β-catenin信号通路~([1,2]),但我们证明h TERT在FOXM1介导的Wnt/β-catenin通路基因激活中发挥了重要作用。简而言之,我们的研究为靶向FOXM1-h TERT轴治疗胃癌提供了新的理论依据。研究背景和目的:胃癌(Gastric cancer,GC)是我国常见的恶性肿瘤之一,根据最新的中国癌症报告,每年约有48万人被诊断为胃癌患者,同时每年约37万人死于胃癌。并且由于缺乏筛查意识,临床就诊早期病例少、早诊率低,大多数胃癌患者确诊时已是进展期,晚期胃癌患者5年生存率低于40%。当前,肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的十大特征之一,肿瘤细胞在各种因素的作用下逃脱机体免疫系统的监视,促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。有文献报道,肿瘤细胞可以通过下调肿瘤抗原表达、异常激活致癌信号、诱导免疫抑制肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)以及宿主肠道菌群失调等多种机制来逃避免疫杀伤。而近年来针对免疫逃逸环节的免疫疗法在胃癌患者中取得了显著的成功,但仍有相当多患者初始治疗无效或出现继发耐药。因此,阐明胃癌的免疫逃逸机制对于扩大受益人群,拓宽胃癌免疫治疗之路具有重要意义。随着对肿瘤免疫逃逸机制的深入研究,已经证实程序性死亡受体配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)能够与肿瘤微环境相互作用,从而导致胃癌发生免疫逃逸。近年来的研究表明,PD-L1在胃癌中的表达与不良预后呈正相关,并且可作为胃癌免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade,ICB)治疗效果良好的重要标志物。随着个体化精准治疗策略的发展,基于PD-1/PD-L1靶点的免疫治疗已成为胃癌越来越重要的治疗手段。然而,在临床应用中,单一ICB治疗有效率偏低。因此寻找联合ICB治疗方案是提高胃癌免疫治疗效果关键所在,尤其是探索免疫检查点双靶点阻断剂联合使用具有很大潜力。因此,进一步探究调节PD-L1的分子机制、开发新型靶向药物以及评估这些药物与ICB治疗的协同作用,将对胃癌的临床治疗具有极其重要的影响。奥利司他(Orlistat)是一种特异性胃肠道脂肪酶抑制剂,它可以有效抑制脂肪酶的活性,从而使人体无法吸收食物中的脂肪,是FDA和SFDA第一个批准用于肥胖症的小分子化合物。已有研究表明其通过直接抑制脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)活性,进而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭与迁移、血管生成,并可诱导细胞凋亡,在多种癌症中显现出抗肿瘤效应[1-3]。此外,奥利司他还可以刺激宿主的免疫系统,一些研究显示,奥利司他的使用可以增强巨噬细胞的抗肿瘤活性,促进T细胞的增殖和激活,从而增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和清除作用[4,5]。因此,奥利司他在免疫治疗领域具有广阔的应用前景,但其确切作用机制仍需进一步研究。免疫治疗在癌症治疗中已经取得了显著进展,但其应答率仍有待提高。我们报道了一种药物奥利司他,该药物被FDA批准用于肥胖治疗,可以通过抑制PD-L1表达来增强CTLA-4阻断剂免疫治疗的效果。具体而言,奥利司他通过抑制AKT-FOXO3a-FOXM1通路来抑制PD-L1基因转录。此外,我们还发现FOXO3a和FOXM1相互抑制:FOXO3a可抑制FOXM1转录,而FOXM1则通过激活AKT来降低FOXO3a蛋白表达,其中FOXM1是通过促进AKT和上游磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(3-Phosphoinositide-dependent protein kinase 1,PDK1)之间的相互作用来实现AKT激活。这些结果证明FOXM1在促进免疫逃逸方面具有关键功能,并支持将奥利司他与CTLA-4阻断剂联合使用以促进免疫治疗效果Ocular microbiome。研究方法:1.通过染色质免疫沉淀(Ch IP)实验探究FOXO3a与FOXM1启动子以及FOXM1与PD-L1启动子结合区域。2.通过免疫共沉淀实验(Co-IP)检测FOXM1对AKT-PDK1结合的影响,探究FOXM1和AKT以及FOXM1和PDK1结合区域。3.利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除FOXM1的MGC803胃癌细胞系,并探究FOXM1敲除后奥利司他对PD-L1的调控情况。4.采用基因集富集分析法(GSEA)分析奥利司他抑制PD-L1表达的上游信号通路。5.为了探索AKT蛋白和奥利司他之间的相互作用,使用Auto Dock软件进行分子对接,并通过细胞热位移实验(Cellμlar thermal shift assay,CETSA)进一步证实。6.探索奥利司他和/或抗CTLA-4抗体对携带MC38肿瘤的同基因小鼠的影响。通过流式细胞术检测来自MC38荷瘤小鼠分离肿瘤中的CD8+T细胞和CD4+T细胞比例(n=5)。7.应用多重荧光免疫组化技术,分析胃癌患者临床组织中PD-L1与FOXO3a以及PD-L1与FOXM1表达的相关性。结果:1.通过染色质免疫沉淀(Ch IP)实验发现,FOXO3a与FOXM1启动子的(-475~-844bp)区域存在结合,FOXM1结合在PD-L1启动子的(+222~+450 bp)区域。2.Co-IP实验表明,过表达FOXM1明显促进AKT和PDK1相互作用。此外,FOXM1的C端分别和PDK1的N端以及AKT的PH端相互结合。3.通过Western blot实验发现,FOXM1敲除后奥利司他对PD-L1抑制作用明显减轻,说明FOXM1在奥利司他下调PD-L1中起着关键作用。4.根据GSEA分析结果,PI3k-AKT信号通路显著富集。而FOXO3a是AKT经典的下游分子,AKT可以在Thr32和Ser253位点磷酸化FOXO3a,磷酸化的FOXO3a会出核降解,并且FOXO3a已被报道在多种肿瘤中抑制FOXM1转录。因此,我们下一步探究奥利司他对PD-L1转录的抑制是否由AKT-FOXO3a-FOXM1途径介导。5.AutoDock分子对接显示,奥利司他与AKT Tyr38和Tyr326位点通过氢键直接相互作用,原子间距离分别为1.9(?)和3.4(?)。与此一致的是,细胞热位移实验表明奥利司他可以增强AKT蛋白的热稳定性,支持了AKT和奥利司他之间存在相互作用。6.奥利司他和CTLA-4单抗联合治疗显著减缓了肿瘤进展,与单独使用任一种药物相比表现出更好的总体存活率,具有更小的肿瘤大小和肿瘤重量。此外,联合治疗组的肿瘤有更多的肿瘤浸润CD8+T细胞,但CD4+T细胞比例没有明显差异。7.根据多重荧光免疫组化结果分析,FOXO3a在肿瘤中低表达,而PD-L1和FOXM1在肿瘤中高表达,并且FOXO3a和PD-L1表达呈现负相关,而FOXM1表达和PD-L1表达之间呈正相关。结论:共靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1是目前最有效的癌症免疫疗法,因为CTLA-4和PD-L1在T细胞活化的不同阶段具有不同的功能[6,7]。我们的结果表明,奥利司他可以通过下调肿瘤细胞上PD-L1的m RNA和蛋白水平来提高CTLA-4抗体的效力。同时,我们也扩展了对AKT-FOXO3a-FOXM1环路的理解。一方面,FOXO3a直接与FOXM1启动子相互作用,对FOXM1进行转录调控;另一方面,FOXM1通过促进PDK1与AKT的相互作用激活AKT,从而促进FOXO3a磷酸化及后续降解。总体而言,FOXM1促进肿瘤免疫逃避的通路可以成为一个重要靶点来开发新型抗癌药物,将奥利司他与CTLA-4抗体联合使用是一种潜在的肿瘤治疗新策略。