中国人群胰腺癌胚系突变谱及CFTR突变的功能研究

胰腺癌起病隐匿,病程进展快,治疗效果差,预后不良。2020年数据显示,胰腺癌病死率在恶性肿瘤中排名第四,是消化系统第二常见的恶性肿瘤;预计2030年,胰腺癌的病死率将跃居肿瘤死因第二位,仅次于肺癌。由于胰腺癌发病隐匿,早期诊断困难,大部分患者在诊断时即为局部进展期或晚期,可直接手术的患者不超过25%。胰腺癌发病率约为5.1/10万人,相对其他恶性肿瘤较低,开展大规模人群筛查的收益小,因此锁定胰腺癌的高危人群进行针对性的检查,可以提高阳性检出率,减少医疗资源浪费。罹患胰腺癌的危险因素可以分为:非遗传性因素,取决于生活方式和环境对于人体的影响;遗传性因素,与个体的遗传背景息息相关。一项10,389例散发肿瘤病例的胚系基因研究显示,近15%的胰腺癌患者携带致病性的胚系突变,超越乳腺癌,位居恶性肿瘤第三位。国际胰腺癌病例对照联盟(Pancreatic Cancer Case-Control Consortium,Pan C4)最新公布的数据显示,胰腺癌的遗传率可能是既往预测的两倍之多,达到21.2%。另一研究表明,近一半的胰腺癌高危人群携带肿瘤易感性基因胚系突变。由于致病性胚系突变在胰腺癌临床治疗和家系管理中具有重要CP-690550抑制剂意义,并且高通量测序为识别携带易感基因胚系突变的患者提供了更为简单且准确的检测方式,美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)最新临床指南提出,即使没有明显的家族史,所有新诊断的胰腺癌患者都应进行遗传综合征的风险评估,也需要考虑进行基因胚系突变检测。随着二代测序技术的发展及其在临床实践中的广泛应用,众多研究团队积累了大量的临床样本测序数据,为大规模人群的胚系研究奠定了坚实的基础。此外,各大学术联盟建立了大量的人群测序数据库,如基因组聚合数据库(Genome Aggregation Database,gnom AD)和千人基因组(1000 Genome,1000G)等,收集和整理了各种大规模的全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和全基因组测序(whole genome sequence,WGS)数据。不同于体细胞突变,胚系突变更具有种族异质性,现有研究和测序数据大多聚焦于欧洲人,并不能充分指示中国人群胚系突变特征。因此,建立大型的中国人群胰腺癌胚系突变研究队列,对研究中国人群胰腺癌胚系突变特征和胰腺癌遗传背景特征有重要意义。此外,胚系突变中还有大量的意义未明变异有待进一步探索,以明确其致病性,这对患者的疾病风险管理及对基因测序技术在临床的应用均有极为重要的意义。基于国内外胰腺癌胚系突变的研究现状,我们建立了2,944例中国健康人群对照队列和1,123例中国胰腺癌患者队列,首次从基因组学、转录组学、表观遗传学等多组学层次描绘了中国人群胰腺癌胚系突变全景图谱,将意义未明变异纳入研究,并首次鉴定到囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)在中国人群胰腺癌中的高频突变,明确了CFTR在胰腺癌中的表达特征,并结合临床数据分析了CFTR对胰腺癌预后的影响,最后通过体外实验验证了CFTR的抑癌基因功能,探索了CFTR意义未明变异对其功能的影响。第一部分中国人群胰腺癌胚系突变基因图谱绘制目的:改进和优化胚系突变检测、过滤和注释流程;描绘中国人群胰腺癌胚系突变全景图谱;鉴定突变基因的“二次打击”事件;分析有害胚系突变和临床病理的相关性;比较胰腺癌和其他癌种的胚系突变谱。方法:1.回顾性收集本中心数据库中符合入排标准的患者,另外建立前瞻性研究队列,根据患者基因测序数据类型将患者划分为发现队列,验证队列和功能验证队列。2.处理测序数据,根据GATK和Var Scan2标准流程检测突变,建立胚系突变的过滤和注释流程;利用Control Free C和GISTIC软件分析整合拷贝数变异数据;结合突变和拷贝数变异结果鉴定杂合性缺失事件。3.采用统计软件R(Version 4.1.0)进行统计学分析。计数资料的组间比较通过χ2或者Fisher’s精确检验计算,计量资料的组间比较通过t检验或两独立样本MannWhitney U秩和检验计算。双侧p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.建立了中国最大人群的胰腺癌胚系研究队列,共纳入1,123例胰腺癌患者及类器官样本和2,499例健康对照人群,包括发现队列(N=389,WGS数据108例,WES数据281例)、验证队列(N=665,PANEL数据)和功能验证队列(N=69,类器官样本,WGS数据),健康人群队列(N=2,944)。2.描绘了中国人群胰腺癌胚系突变图谱,发现了6条高频突变通路,其中CFTR是最高频突变的基因,并在26个抑癌基因中检测到35个杂合性缺失事件。3.通过分析发现携带有害胚系突变及CFTR胚系突变的患者更年轻(携带有害胚系突变患者年龄vs.未携带有害胚系突变患者年龄=60.00 vs.62.00,p=0.025,携带CFTR胚系突变患者年龄vs.未携带CFTR胚系突变患者年龄=56.00 vs.62.00,p=0.033),这些患者有更高比例的家族肿瘤史(携带有害胚系突变vs.未携带有害胚系突变=27.63%vs.15.69%,p=0.002,携带CFTR胚系突变vs.未携带CFTR胚系突变=42.42%vs.24.32%,p=0.019),和更高比例的个人肿瘤史(携带有害胚系突变vs.未携带有害胚系突变=10.53%vs.4.58%,p=0.015,携带CFTR胚系突变vs.未携带CFTR胚系突变=15.15%vs.5.83%,p=0.047),并且CFTR胚系突变患者中女性患者比例更高(57.58%vs.38.44%,p=0.027),CFTR胚系突变患者也更易罹患慢性胰腺炎(18.18%vs.2.98%,p<0.001)。4.比较胰腺癌和其他12种肿瘤中CFTR突变频率,发现CFTR在胰腺癌中突变频率最高,为3.9%,其次是宫颈癌和子宫内膜癌,分别为3.8%和3.6%,其余肿瘤突变频率均小于2%。结论:本研究首次发现了CFTR是胰腺癌高频的胚系突变基因,在胰腺癌中突变频率为3.9%,携带有害胚系突变及CFTR胚系突变的患者更年轻,有更高比例的家族肿瘤史和个人肿瘤史,且CFTR胚系突变中女性患者占比更高,且更易有慢性胰腺炎病史。上述发现为下一步研究确定了方向。第二部分CFTR的表达特征及其与胰腺癌预后的相关性分析目的:结合临床患者的病理、预后信息数据,分析CFTR在胰腺癌组织、癌旁组织的表达,阐明CFTR表达与胰腺癌预后的相关性,探索其可能的调控机制,以及启动子甲基化和胚系突变对CFTR表达的影响。方法:1.分析108例胰腺癌患者肿瘤/癌旁组织RNA测序数据得到CFTR的表达量,按照CFTR表达量中位数将患者分为高低两组,分析两组预后差异;为避免肿瘤纯度影响,利用类器官测序数据再次进行分析;并利用公共数据库中的大块组织测序和显微切割样本测序数据验证结果。2.免疫组化染色分析胰腺癌患者肿瘤/癌旁组织中CFTR的表达,并通过软件进行定量分析,根据CFTR表达量中位数将患者分为高低两组,分析两组预后差异。3.利用类器官和细胞系样本,通过甲基化特异性PCR和染色质开放性测序分析CFTR启动子甲基化和染色质开放性对其表达的影响。结果:1.通过比较肿瘤和癌旁组织的CFTR RNA表达量和免疫组化定量结果,发现CFTR在肿瘤组织中表达下调。2.比较肿瘤中不同CFTR RNA表达量和免疫组化定量的biopolymer extraction患者临床特征差异,发现CFTR高表达的患者有更好的预后[高表达vs.低表达,大块组织测序(总生存期):22.9(14.0-31.8)vs.15.9(11.1-20.7),p>0.05;类器官(无病生存期):13.8(9.5-29.0)vs.3.3(5.9-18.7),p<0.05;公共数据库大块组织测序(总生存期):23.3(3.6-43.0)vs.16.5(12.0-21.0),p>0.05;公共数据库显微切割样本(总生存期):21.9(13.6-30.2)vs.6.6(3.7-9.5),p<0.01],其结果在纯度更高的类器官和显微切割样本中更为明显。通过免疫组化定量分析也得到相同的结果[总生存期:高表达组vs.低表达组=27.7(22.9-32.5)vs.15.0(8.3-21.7),p<0.05]。3.甲基化特异性PCR和染色质开放性测序分析发现,CFTR低表达的类器官样本中,CFTR启动子区域呈现出高甲基化的状态,并且染色质开放性更低。4.通过比较CFTR野生型样本和突变型样本的RNA表达量和免疫组化定量数据发现,胚系突变可引起CFTR的表达下调。结论:本研究发现CFTR表达与胰腺癌患者的预后具有相关性,CFTR在胰腺癌中具有抑癌基因的特征,且CFTR表达受到表观遗传调控,其具体功能有待进一步研究。第三部分CFTR及其突变亚型的抑癌功能目的:通过体外实验明确CFTR在胰腺癌中的抑癌功能,并明确不同的突变亚型对其功能的影响。方法1.构建PANC03.27和SU86.86 CFTR敲减细胞株,ASPC1和PANC-1 CFTR过表达细胞株,并利用PANC-1细胞株构建9株CFTR突变过表达稳转株。2.通过q PCFG-4592配制R和WB实验鉴定转染结果。3.通过CCK-8实验、平板克隆形成实验评价胰腺癌细胞增殖活性;检测胰腺癌细胞的迁移/侵袭能力,利用流式细胞术分析胰腺癌细胞的凋亡和检测细胞周期。结果:1.成功构建和鉴定了CFTR敲减/过表达和9株突变过表达稳转株。2.CFTR过表达导致胰腺癌细胞系增殖、迁移/侵袭能力减弱,细胞凋亡增加,促使更多细胞停留在G0-G1期。CFTR敲减促进胰腺癌细胞系增殖。3.相较于CFTR过表达细胞株,9株突变CFTR细胞株对细胞增殖功能的抑制相对减弱。结论:CFTR在体外可抑制胰腺癌细胞的增殖活性,降低其迁移/侵袭能力,并促进细胞凋亡,发挥抑癌基因功能,CFTR特定位点突变导致其功能受损。