研究背景葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)是起源于葡萄膜的高侵袭性肿瘤,多发于成年人眼球后极部,严重损害患者视功能和生命健康。尽管50%的UM会发生转移,但是对于体积较小的UM,发生远处转移的风险极低。因此,对于UM患者来说,要做到早期诊断和及早干预,减少远端血行转移的可能性,以确保更完整的视觉功能和更长的生命存续期。当前,UM眼部治疗措施为个性化治疗,根据肿瘤的位置、体积、临床特征以及患者的基本情况选择合适的治疗措施。治疗的目的是实现对肿瘤的局部控制并降低病理转移的风险,同时最大限度保留眼球完整性和眼睛视功能。常用的UM眼部治疗方法有放射治疗、局部手术治疗、经瞳孔温热疗法(Transpupillary thermotherapy,TTT)和光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)等。巩膜外敷贴放疗(External scleral plaque radiotherapy,PRT)是目前最常用的放射治疗方式,与经眼球摘除术的患者相比,经PRT治疗的患者可以保留有用的视力和完整的眼球,并且预后无明显差异。但是,PRT非常依赖外科医生的手术操作,并且巩膜外放射物极易损伤肿瘤周围健康组织,出现白内障、新生血管性青光眼以及视网膜脱离等并发症。局部切除术可以完整的切除Ubiomedical detectionM肿瘤组织并尽可能的保留眼球的完整性,同时也可以获得新鲜组织标本进行后续诊断和基因检测。但是,肿瘤局部切除术难度较大,对手术医生的技术和手术经验要求较高,并且肿瘤局部切除术极易造成肿瘤细胞播散。TTT和PDT主要作为放疗的备选方案,临床疗效有限,并且存在潜在的并发症。故探讨和研究新的UM眼部治疗方式具有重要意义。化学动力疗法(Chemodynamic therapy,CDT)是一类新型的肿瘤治疗技术,自2016年被提出后引起广泛关注。与以往传统肿瘤诊疗技术不同,CDT依靠肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)自身化学产物发生转化反应,发挥抗肿瘤作用。传统的CDT的核心是由二价铁离子(Fe2+)等过渡金属离子构成的纳米材料,催化TME中过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2),发生芬顿反应(或类芬顿反应),产生具有强氧化能力的羟基自由基(Hydroxyl radical,·OH),导致肿瘤细胞脂质过氧化、蛋白失活等,最终导致细胞死亡。在正常组织内,H2O2含量低,无法和纳米材料反应产生足够的·OH,展现出良好的生物相容性,CDT在肿瘤治疗方面展现出良好的应用潜力有望用于UM的治疗。但是,常用的过渡金属纳米材料催化效能有限,体内降解性低,存在潜在的长期毒性。需要开发尺寸更小,可生物降解且具有高效芬顿催化反应活性的CDT纳米材料用于UM的局部治疗。在我们之前的研究中,我们通过自行设计的一种简单快速的“微爆法”,成功制备了非氧化 MXene-Ti3C2Tx 量子点(MXene-Ti3C2Tx quantum dots,NMQDs-Ti3C2Tx)。NMQDs-Ti3C2Tx具有超小的粒子尺寸,平均横向直径为7.23nm,平均厚度为5nm。与Fe2+相比,NMQDs-Ti3C2Tx具有优异的类芬顿催化性能。NMQDs-Ti3C2Tx对宫颈癌、乳腺癌展现出了强大的杀伤作用,此外,NMQDs-Ti3C2Tx在生物体内也展现出了良好的生物相容性。但是,NMQDs-Ti3C2Tx对UM肿瘤的作用以及NMQDs-Ti3C2Tx在眼内的生物相容性目前未知,尚无相关文献报道。在本研究的第一部分,我们拟从NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移等生物学行为的影响入手,探讨NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞的影响以及具体的作用机制;在第二部分,我们讨论NMQDs-Ti3C2Tx在体内UM模型中的作用,并且进一步探讨其对正常眼内细胞的毒性作用和眼内生物相容性。通过我们的研究,为UM的临床早期治疗提供新的治疗方式和思路。第一部分NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞生物学行为的影响以及对UM细胞作用机制的研究研究目的肿瘤的增殖、克隆形成、侵袭和迁移等生物学行为导致了肿瘤的发生和转移,本部分旨在研究NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞生物学的影响,并进一步探究NMQDs-Ti3C2Tx在UM细胞内的作用机制。研究方法1.制备 NMQDs-Ti3C2Tx首先,我们通过传统刻蚀法制备NMQDs-Ti3C2Tx的原材料MXene-Ti3C2Tx,并使用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)对 MXene-Ti3C2Tx 进行表征;之后,我们利用液氮和高温去离子水的温差产生“微爆”来制备NMQDs-Ti3C2Tx,并使用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)对 NMQDs-Ti3C2Tx 进行表征。2.实验细胞的培养及处理本实验使用人UM细胞系:C918和MUM-2B,两种细胞系均使用含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的RPMI-1640培养基,培养于37℃含有5%二氧化碳(Carbon dioxide,CO2)的细胞培养箱中。主要处理如下:将制备好的NMQDs-Ti3C2Tx配置成水溶液与UM细胞共培养,从而分析和观察NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞生物学行为的影响。3.UM细胞活力检测使用CCK-8法检测细胞活力。将C918和MUM-2B细胞分别给予不同浓度的NMQDs-Ti3C2Tx(浓度梯度为 0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL 和200μg/mL)刺激,于12小时、24小时和36小时后在UM细胞中加入CCK-8试剂,最后使用酶标仪测定吸光度。4.UM细胞克隆形成实验将C918和MUM-2B细胞分别给予不同浓度的NMQDs-Ti3C2Tx水溶液(与CCK-8实验相一致),每3天进行一次换液,14天后,收集细胞统计克隆数,计算克隆率。5.UM细胞活/死染色实验使用0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL 的 NMQDs-Ti3C2Tx 刺激 C918 和MUM-2B细胞,6小时后使用活/死细胞染色试剂对Uselleck HPLCM细胞进行染色,观察UM细胞活细胞和死细胞情况,结合CCK-8试验结果,为下一步实验确定实验浓度和刺激时间。6.划痕实验和Transwell实验使用0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL 的 NMQDs-Ti3C2Tx 刺激 C918 和 MUM-2B 细胞,6小时后收集细胞进行划痕实验和Transwell实验,观察NMQDs-Ti3C2Tx对UM细胞迁移和侵袭能力的影响。7.UM细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和脂质过氧化物检测将C918细胞和MUM-2B细胞与NMQDs-Ti3C2Tx共培养。6个小时后,分别使用ROS检测荧光探针(H2DCFDA)和脂质过氧化荧光探针(C11 BODIPY 581/591)标记UM细胞,最后进行流式细胞学实验检测ROS以及脂质过氧化物含量。更多8.UM 细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞6小时后,使用细胞裂解液提取UM细胞总蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,之后使用MDA检测试剂盒进行MDA检测。9.UM细胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞,6小时后收集细胞,使用GSH检测试剂盒检测GSH。10.UM细胞线粒体膜电位(Membrane potential,MMP)检测将C918细胞和MUM-2B细胞与NMQDs-Ti3C2Tx共培养。6小时后,使用MMP检测荧光探针(TMRM)对细胞进行染色,然后进行流式细胞学实验检测MMP变化。11.UM细胞线粒体及溶酶体形态检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞,6小时后收集并使用电镜固定液固定细胞。使用透射电子显微镜观察线粒体及溶酶体形态。12.UM细胞内NMQDs-Ti3C2Tx与线粒体和溶酶体共定位检测使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞1小时后,加入线粒体红色荧光探针(Mito-Tracker Red)标记UM细胞线粒体,使用荧光显微镜观察NMQDs-Ti3C2Tx与线粒体共定位情况。使用溶酶体红色荧光探针(Lyso-Tracker Red)标记UM细胞的溶酶体,观察NMQDs-Ti3C2Tx与溶酶体共定位情况。13.定量实时荧光PCR(qPCR)使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918细胞和MUM-2B细胞1小时后,提取细胞总RNA,使用逆转录试剂盒进行RNA反转录,然后通过qPCR获取目的基因SLC7A11、PTGS2和LC3的Ct值,以GAPDH为内参基因,计算SLC7A11、PTGS2和LC3的表达水平。14.数据统计及分析所有实验至少重复3次,所得数据使用软件GraphPad Prism 7进行统计、分析及绘图。P值小于0.05具有统计学差异。研究结果1.使用“微爆法”成功制备NMQDs-Ti3C2Tx我们使用SEM对所制备的MXene-Ti3C2Tx进行表征,发现MXene-Ti3C2Tx具有MXene典型的“手风琴”样结构;使用TEM对所制备NMQDs-Ti3C2Tx进行表征,发现NMQDs-Ti3C2Tx具有规则的“类圆盘样”形状,表明NMQDs-Ti3C2Tx制备成功。2.NMQDs-Ti3C2Tx抑制UM细胞的增殖和克隆形成CCK-8结果显示,与NMQDs-Ti3C2Tx共培养后,C918和MUM-2B细胞的增殖和克隆形成受到明显抑制,并随着NMQDs-Ti3C2Tx浓度的增加,抑制效果越明显。结合活/死细胞染色结果,在后续的实验中,为避免细胞死亡对实验结果的影响,选用50μg/mL和100μg/mL作为NMQDs-Ti3C2Tx的实验浓度,6小时作为刺激时间。3.与NMQDs-Ti3C2Tx共培养后,UM的侵袭和迁移能力受到抑制使用 0μg/mL、50μg/mL 及 100μg/mL 的 NMQDs-Ti3C2Tx 刺激 UM 细胞 6 小时,收集细胞后进行划痕实验和Transwell实验,结果显示,与对照组(0μg/mL)相比,NMQDs-Ti3C2Tx明显抑制了 C918和MUM-2B细胞的侵袭和迁移能力。4.NMQDs-Ti3C2Tx破坏UM细胞内氧化还原稳态使用NMQDs-Ti3C2Tx刺激C918和MUM-2B细胞6小时后,与对照组(0μg/mL)相比,UM细胞内的总ROS含量升高,脂质过氧化程度升高;此外,GSH含量也明显下降,提示NMQDs-Ti3C2Tx破坏了 UM细胞内氧化还原稳态。5.NMQDs-Ti3C2Tx导致UM细胞发生铁死亡qPCR结果显示,加入NMQDs-Ti3C2Tx后,C918和MUM-2B细胞内的SLC7A11和PTGS2基因的mRNA水平上调,并且UM细胞线粒体嵴减少,线粒体膜断裂,提示经过NMQDs-Ti3C2Tx刺激之后,UM细胞发生了铁死亡。6.NMQDs-Ti3C2Tx导致UM细胞线粒体稳态破坏通过对C918和MUM-2B细胞内的线粒体进行标记,我们发现NMQDs-Ti3C2Tx与UM细胞内的线粒体共定位。提示NMQDs-Ti3C2Tx可能直接作用于UM细胞内线粒体;通过进一步分析UM细胞内的MMP,我们发现NMQDs-Ti3C2Tx刺激后,UM细胞内MMP明显降低,提示线粒体受到损伤;我们进一步使用透射电镜直接观察线粒体形态,我们发现线粒体形态发生明显改变,说明NMQDs-Ti3C2Tx导致线粒体稳态破坏。7.NMQDs-Ti3C2Tx导致UM细胞溶酶体破坏通过qPCR,我们发现UM细胞内自噬相关LC3基因mRNA水平上调。通过透射电镜,我们在自噬溶酶体内发现损伤的线粒体,这些结果提示NMQDs-Ti3C2Tx刺激后,UM细胞发生了线粒体自噬。在自噬溶酶体内,我们发现了黑灰色颗粒并且自噬溶酶体膜完整性遭到破坏;通过对UM细胞内的溶酶体进行标记,我们发现NMQDs-Ti3C2Tx与UM细胞内的溶酶体共定位,说明NMQDs-Ti3C2Tx在溶酶体内代谢,自噬溶酶体内黑灰色颗粒为溶酶体吞噬的NMQDs-Ti3C2Tx,NMQDs-Ti3C2Tx在溶酶体酸性环境下进一步反应,破坏了自噬溶酶体。实验结论1.NMQDs-Ti3C2Tx可以明显抑制UM细胞(C918和MUM-2B)增殖,克隆形成,侵袭和迁移等生物学行为;2.NMQDs-Ti3C2Tx通过破坏UM细胞氧化还原平衡导致铁死亡;3.NMQDs-Ti3C2Tx攻击UM细胞线粒体,导致线粒体损伤和线粒体自噬;4.NMQDs-Ti3C2Tx破坏溶酶体,终止线粒体自噬,加剧细胞死亡。第二部分NMQDs-Ti3C2Tx对裸鼠体内UM发生的影响以及其在眼内生物相容性的研究研究目的第一部分中,我们在体外实验中发现NMQDs-Ti3C2Tx通过影响UM细胞的氧化还原代谢、线粒体稳态等机制抑制了 UM细胞的增殖,克隆形成,侵袭和迁移等生物学行为。但是,NMQDs-Ti3C2Tx在体内对UM肿瘤的影响未知。本部分通过构建UM裸鼠肿瘤模型,进一步观察NMQDs-Ti3C2Tx对UM肿瘤的影响;此外,通过将NMQDs-Ti3C2Tx 与视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium,RPE)共培养,观察NMQDs-Ti3C2Tx对正常眼内细胞的作用;通过玻璃体腔注射NMQDs-Ti3C2Tx,观察其在眼内的生物相容性。研究方法1.实验动物使用BALB/c裸鼠构建UM皮下肿瘤模型;使用C57BL/6小鼠进行眼内注射。2.实验动物分组选取4周龄的雌性BALB/c裸鼠8只,将C918细胞悬液注射于裸鼠皮下成瘤。之后随机分为两组进行药物注射(每2天注射一次),每组4只:对照组(生理盐水),实验组(NMQDs-Ti3C2Tx水溶液)。选取4周龄的雌性C57BL/6小鼠6只进行眼内药物注射,随机分为两组,每组3只:对照组(生理盐水),实验组(NMQDs-Ti3C2Tx水溶液)。3.实验细胞的培养及处理本实验所使用C918细胞系,培养同第一部分;人ARPE-19细胞系,使用含有10%FBS的DMEM培养基,培养于含有5%CO2的细胞培养箱中。主要处理如下:将NMQDs-Ti3C2Tx与ARPE-19细胞共培养,分别于12小时、24小时以及36小时进行CCK-8实验,观察NMQDs-Ti3C2Tx对ARPE-19细胞增殖的影响;将NMQDs-Ti3C2Tx与ARPE-19细胞共培养6小时后,进行流式细胞学分析,观察ARPE-19细胞内的ROS、脂质过氧化物以及MMP的变化。4.裸鼠体重和瘤体体积测量每次药物注射前使用电子天平称量裸鼠的体重,每只测量3次取平均值作为最终体重数据;使用游标卡尺测量瘤体长短径,并计算瘤体体积。5.C57BL/6小鼠玻璃体腔注药C57BL/6小鼠麻醉后,眼部滴用表面麻醉剂并散瞳,使用29G手术针角膜缘后做巩膜切口,汉密尔顿微量注射器进行玻璃体腔药物注射。术后3天,对小鼠进行眼底光学相干断层扫描(Optical Coherence Tomography,OCT)。6.组织取材实验结束后,给予小鼠安乐死,留取裸鼠瘤体以及C57BL/6小鼠眼球。部分组织置入液氮内速冻,之后转入-80℃冰箱内长期保存;部分组织放入4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)固定,以备后续使用。7.组织病理学检测对裸鼠瘤体以及C57BL/6小鼠眼球制备组织切片,并进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色。8.数据统计及分析对实验所得数据进行整理,使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析及绘图,P值小于0.05具有统计学差异。研究结果1.NMQDs-Ti3C2Tx抑制UM皮下荷瘤的增殖。通过裸鼠皮下荷瘤实验,我们发现,实验组瘤体的体积和重量明显小于对照组瘤体的体积和重量。通过对瘤体组织H&E染色,我们发现实验组肿瘤注射部位附近出现大片坏死,而远离注射部位的瘤体组织没有受到影响。2.NMQDs-Ti3C2Tx不影响ARPE-19细胞的活力。通过CCK-8实验,我们发现,即使使用200μg/mL的NMQDs-Ti3C2Tx刺激ARPE-19细胞36小时,ARPE-19细胞的活力没有受到明显的影响。通过活/死染色实验,我们也没有观察到明显的死细胞产生。3.NMQDs-Ti3C2Tx不影响ARPE-19细胞氧化还原代谢和线粒体稳态。通过流式细胞学分析,ARPE-19细胞经过NMQDs-Ti3C2Tx刺激之后,细胞内的总ROS以及脂质过氧化物含量没有升高;并且,NMQDs-Ti3C2Tx对ARPE-19细胞的MMP没有明显影响。4.NMQDs-Ti3C2Tx对小鼠眼内组织没有明显破坏作用。小鼠眼内注射NMQDs-Ti3C2Tx后,我们通过OCT分析发现,实验组和对照组小鼠眼底图像没有明显差异,视网膜厚度也没有发生明显改变;我们进一步通过H&E染色发现,两组小鼠眼球切片细胞形态规则,没有明显差异。实验结论1.NMQDs-Ti3C2Tx具有强大的破坏肿瘤的能力,可以明显抑制裸鼠注射部位UM肿瘤的生长。2.NMQDs-Ti3C2Tx对RPE细胞没有毒性作用且在眼内有良好的生物相容性。