背景:随着组织工程技术的发展,有关牙周膜干细胞成骨向分化相关潜能的研究众多,然而其对破骨细胞分化的调控机制尚不清楚。胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)作为细胞间通讯的重要物质可能参与了这一过程。此外,牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的压力加载(Compressive force,CF)通常使用重力加压装置,研究表明重力加压方式存在加力不均等问题。因此构建稳定的牙周膜干细胞压力加载模型,并探索EVs是否参与了牙周膜干细胞对破骨细胞的分化调控具有重要意义。目的:本研究旨在构建三维培养的PDLSCs压力加载模型,探讨压力作用下PDLSCs来源EVs对RAW264.7细胞破骨向分化的影响,同时对机械压应力影响PDLSC寻找更多s释放EVs的机制进行探索。方法:1.分离人牙周膜干细胞并进行鉴定,将其接种在以Ⅰ型胶原为主要成分的支架中,并接种在Biopress压力培养板中,使用Flexcell-5000C压力培养箱对其进行压力加载,活死细胞染色检测PDLSCs在支架中活性,鬼笔环肽染色观察细胞骨架改变。2.分组:不加压对照组(Control);压力加载实验组(力值:5KPa,25KPa,45KPa,65KPa;时间:2h,6h,12h;)3.提取各实验组PDLSCs细胞上清,作为条件培养基加入RAW264.7细胞中;TRAP染色检测红染阳性的破骨细胞,Rt-PCR检测RAW264.7细胞中破骨相关基因TRAP,Cts-K及MMP-9的m RNA表达水平。以获取各加压组中促破骨分化能力最强的组别。4.免疫荧光实验,Rt-PCR及Western Blot检测该组压力加载下PDLSCs细胞中BMAL1的表达,同时应用抑制剂GSK4112抑制PDLSCs中BMAL1的表达。5.超速离心法提取各实验组PDLSCs细胞上清中的EVs,透射电镜(TEM)观察EVs形态特征,NTA检测EVs粒径及电位,Nano-FCM检测EVs表面标记物CD9,CD63,及CD81;超速离心提取单纯支架组(Scaffold)产物。6.将各组EVs及Scaffold组超速离心后产物作用于RAW264.7细胞,TRAP染色鉴定破骨细胞数目,Rt-PCR、Western Blot检测破骨相关基因m RNA及蛋白表达水平。结果:1.TRAP染色及Q-PCR结果显示,当压力加载数值为45KPa,12h时,牙周膜干细胞上清的促破骨分化作用最强。活死细胞染色及F-Actin染色显示压力作用下支架内牙周膜干细胞状态良好;2.免疫荧光实验,WB结果显示压力刺激下PDLSC中BMAL1的表达水平升高;抑制剂GSK4112的使用降低了压力上调的PDLSC中BMAL1的表达。3.TEM示提取的EVs形态为凹形扁盘状;NTA结果显示提取的EVs的平均直径在150nm左右,Talazoparib IC50压力刺激增加了EVs释放,浓度约为不加压对照组的3倍,GSK4112的使用逆转了压力促进EVs释放的作用。纳米流式结果显示提取粒子中CD9,CD63,CD81阳性表达的占比。4.TRAP染色结果示压力组胞外囊泡可诱导RAW264.7分化为破骨细胞;Q-PCR及WB结果显示RAW264.7细胞内破骨相关基因m RNA及蛋白表达水平升高。BMAL1抑制组PDLSCs胞外囊泡的促破骨细胞破骨向分化作用较单纯加压组降低(P<0.05)。结论:1.成功构建了PDLSC的三维压力加载模型,45KPa,12h条件压力加载下,PDLSCs上清促破骨分化作用最强。2.压力加载上调PDLSCs中BMAL1的表达。3.压speech pathology力加载PDLSCs细胞分泌EVs能力增强,BMAL1分子的抑制可降低压力促PDLSCs分泌EVs的作用。4.压力作用下PDLSCs来源EVs可促进RAW264.7细胞破骨向分化,BMAL1分子的抑制可逆转压力作用下PDLSCs来源的EVs的促破骨作用。