银杏(Ginkgo biloba)是我国重要的经济树种。银杏叶片提取物(Ginkgo biloba Extract,GbE)因富含类黄酮、萜内酯等生物活性物质而被广泛应用于心脑血管、老年痴呆等疾病的治疗。银杏自然分布于我国20多个省市,不同海拔地区银杏叶片类黄酮含量存在差异,但其调控机制尚不清楚。本研究以生长在西藏林芝(高海拔)及其引种地江苏邳州(低海拔)地区的5年生银杏实生苗为材料,分析了银杏叶片差异表达基因和差异代谢产物并鉴定出参与类黄酮合成的关键结构基因;通过对银杏苗进行紫外、光强和温度等不同环境因子NSC 119875细胞培养处理,筛选出促进银杏类黄酮积累的主效环境因子和响应的关键基因。主要结果如下:(1)对2个地区的银杏植株生理指标测量分析发现,与邳州地区相比,林芝地区的银杏植株具有较矮小、叶片颜色较黄、叶裂数较少、叶面积较小、叶片鲜重较轻等特点。如邳州地区的株高达到270 cm左右,胸径9.8 mm左右,叶裂3-4个;而西藏林芝地区的株高为190 cm左右,胸径7.8 mm左右,叶裂1-2个。然而,林芝地区的银杏叶片类黄酮含量高达35 mg/g,与低海拔地区相比,升高了 1.59倍。以上结果显示高海拔限制了银杏植株的生长但却显著提高了叶片中类黄酮的积累。(2)通过广泛靶向代谢组学对生长在两个地区的叶片进行分析,共鉴定到黄酮类、脂质、有机酸、氨基酸、酚酸等9大类共310个差异代谢物。高海拔地区的银杏叶片初生代谢物如氨基酸类、脂质、酚酸类等的含量普遍低于低海拔地区,而次生代谢物含量高于低海拔地区,鉴定到8种类黄酮含量存在明显差异,均显著增加,分别为黄酮醇、双黄酮、黄酮碳糖苷、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、异黄酮、黄烷酮。(3)对两个地区的银杏叶片进行转录组测序,共鉴定到2745个差异表达基因。其中32个基因富集到了苯丙素生物合成,除了 6个基因在高海拔地区表达呈上升趋势以外,其余基因的表达均显著下调。类黄酮合成通路共富集到33个基因,大部分基因均在高海拔地区叶片中上调表达,尤其与查尔酮、黄酮醇等物质合成密切相关的结构基因,如C4H和CHS、FLS、F3’H等显著上调表达。代谢组和转录组联合分析显示,高海拔地区银杏叶片类黄酮含量提高的原因可能是由类黄酮合成结构基因表达上升引起的。(4)为了探究高海拔地区银杏叶片高类黄酮合成的影响因素,对一年生银杏实生苗进行不同的环境因子处理,包括不同强度UV-B辐射(0KJ/m2、7.14 KJ/m2、21.42 KJ/m2)、不同温度(25℃、15℃、5℃)和不同光照强度Behavioral genetics(300μmol m-2s-1、500 μmol m-2s-1、800μmol m-2 s-1)处理,并对银杏叶片黄酮含量及关键合成酶GbFLS的基因表达量进行测定。结果表明,与对照相比,UV-B辐射、低温和高光强均能促进银杏叶片类黄酮积累,UV-B辐射处理后黄酮含量最高增加了 2.2倍,低温处理提高了 1.5倍,高光强处理增加了 2.8倍。在所测试的环境因子中,高光强(500μmol m-2 s-1)是促进类黄酮合成的Fer-1化学结构主要环境因子。(5)环境因子处理对类黄酮合成结构基因GbFLS的表达量进行分析,发现GbFLS表达量分别在UV-B、低温和高光强处理后最高分别上调4倍、2.2倍和3.75倍。克隆了GbFLS,瞬时转化银杏愈伤组织及稳定转化拟南芥,与对照相比,GbFLS过量表达愈伤组织的类黄酮含量为野生型的3.5倍,表明GbFLS可以响应多个环境因子并正向调控类黄酮的合成。