偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)是一种生长速度较快的多孔菌科(Polyporaceae)白腐菌,对木材和木质素具有较强的分解能力。在真菌中,C2H2型锌指转录因子主要参与调控生长发育、产孢、碳源代谢、致病性和胁迫应答等过程。SFP1蛋白为C2H2型锌指转录因子的裂指蛋白1,已有研究表明,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)中SFP1锌指转录因子具有调控生长发育、生物膜形成与氧化应激反应等功能,目前在白腐菌中对SFP1蛋白结构和功能的研究尚未开展,有待进行与深入研究。本研究以偏肿革裥菌中Lg-sfp1基因为研究对象,对该基因进行基因克隆、结构鉴定与生物信息学分析,基于同源重组原理构建Lg-sfp1基因敲除载体,运用PEG介导的原生质体转化法得到了△Lg-sfp1基因缺失突变体菌株。通过与野生型(WT)对比分析,初步揭示了Lg-sfp1基因的在偏肿革裥菌中的功能,主要研究结果如下:1、成功克隆并鉴定出Lg-sfp1基因,该基因cDNA全长1947bp。蛋白理化性质结构表明,Lg-sfp1基因编码一个由648个氨基酸组成的亲水性膜内蛋白,蛋白大小为68.27k D,等电点为6.46,不稳定指数为68.04,为不稳定蛋白,脂肪指数为51.20,亲水性平均系数值为-0.61,为亲水性蛋白。蛋白保守结构域预测结果表明,Lg-SFP1蛋白在氨基酸序列的C端含有2个C2H2型锌指结构域,且存在SFP1特征序列,为C2H2型锌指转录因Infection transmission子的裂指蛋白1。Lg-SFP1蛋白进行系统发育树构建表明Lg-SFP1与绒毛栓菌(Trametes pubescens)的SFP1的亲缘关系最近。2、制备偏肿革裥菌原生质体,利用PEG介导的遗传转化法将构建好的敲除载体p KOV21-sfp1转化到原生质体中。经过抗性筛选与PCR检测后得到6株△Lg-sfp1基因敲除突变体菌株,并对6株△Lg-sfp1基因敲除突变体菌株进行实时荧光定量法(qRT-PCR)检测Lg-sfp1基因表达量,最终筛选出1株敲除效果最佳的突变体菌株进行后续功能验证。3、Lg-sfp1基因参与调控偏肿革裥菌菌落形态和生长。在PDA培养基中,与野生型菌株相比,△Lg-sfp1基因敲除突变体生长速率下降,菌株生物量减少,且菌落形态变化显著,纵向生长的selleckchem ICI 46474气生菌丝较多,且菌丝体较厚实。以LNAS基本培养基分别培养△Lg-sfp1基因敲除体与野生型菌株,静置培养3天后,分别在0、2、4、6、8、10d提取对应处理的菌丝RNA,利用q RT-PCR检测生长发育过程中5个与生长Imidazole ketone erastin配制发育相关基因的表达量,△Lg-sfp1基因敲除突变体菌株中5个生长发育与相关基因的表达量与野生型菌株相比均下降。4、Lg-sfp1基因参与调控偏肿革裥菌的胁迫应答。氧化胁迫条件下,在含有低浓度H_2O_2的PDA培养基中,△Lg-sfp1基因敲除突变体的耐受性比野生型低,而随着胁迫因子浓度升高,Lg-sfp1基因敲除突变体的耐受性明显高于野生型。以LNAS基本培养基分别培养△Lg-sfp1基因敲除体与野生型菌株,静置培养3天后,分别在0、2、4、6、8、10d提取对应处理的菌丝RNA。利用q RT-PCR检测6个与胁迫应答相关抗氧化酶基因的表达量,△Lg-sfp1基因敲除突变体菌株中6个与胁迫应答相关抗氧化酶基因的表达量与野生型菌株相比均上升,结果表明Lg-sfp1基因对抗氧化酶的产生有负调控作用。离子胁迫条件下,在含有不同浓度Na Cl和KCl的PDA培养基中,随着盐胁迫因子浓度升高,△Lg-sfp1基因敲除突变体与野生型的生长速度均在不断的降低,但△Lg-sfp1基因敲除突变体与野生型生长速度相比明显降低。综上所述,本研究成功克隆并鉴定出偏肿革裥菌C2H2型锌指转录因子的裂指蛋白1基因Lg-sfp1,并初步分析了Lg-sfp1基因的功能,拓展了分子生物学水平上对偏肿革裥菌生长发育与胁迫应答机制的研究,为白腐菌中SFP1蛋白与功能研究奠定了有力的理论依据。