背景:原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是一类隐匿性的以视神经节细胞进行性退化和视野丢失为特征的视神经病变。我国40岁以上人群POAG的患病率为0.7%～2.6%,其中约10%发展为双眼致盲,严重影响生活质量,增加家庭及社会负担~([1])。该病发生和发展的主要危险因素是升高的眼内压(intraocular pressure,IOP)~([2]),IOP主要由房水产生和排出的平衡决定,对于维持眼睛的稳态和形状至关重要。房水主要通过睫状体的睫状突上皮产生后到达后房,通过瞳孔进入前房。在人类中,约80%的房水由前房角经小梁网进入Schlemm管,少部分房水通过葡萄膜巩膜途径引流~([3])。房水流出的主要阻力位于小梁网的邻管区(juxtacanalicular tissue,JCT)区和Schlemm管的内皮层,是由胶原纤维、蛋白聚糖、纤连蛋白(fibronectin,FN)等细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)组成的复杂网络~([4-6])。在生理情况下,眼睛局部保持一个相对稳定的环境,IOP在正常范围内波动。在青光眼患者中,小梁网细胞的行为被改变,ECM发生重塑导致房水流出阻力增加和升高IOP。因此,抑制这些区域的细胞外基质的重塑,恢复细胞外基质稳态是防止青光眼疾病进展的一个重要方法。肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)不仅参与调节血压、维持体液电解质平衡,而且在心脏~([7])、肝脏~([8])、眼部~([9])等器官的ECM重塑方面也发挥着重要作用。目前,已在眼部组织鉴定出多种RAS系统成分的表达,包括肾素、血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)~([10-12])。其中,AngⅡ是一种八肽激素,是RAS系统中的主要效应因子,可引起ECM重塑、血管收缩、纤维化、炎症、活性氧产生和离子通道功能障碍等。目前,研究表明AngⅡ水平在青光眼患者房水中升高~([13]),可能与青光眼的发病机制密切相关,但关于AngⅡ在青光眼发病过程中的作用及具体分子机制尚不清楚,还需要进一步的研究。目的:分析AngⅡ在POAG和白内障(对照组)患者房水中的浓度差异及其与眼压的关系,探讨AngⅡ对小梁网细胞纤维化的影响及其机制,为RAS系统在眼睛局部的病理意义提供实验证据,为POAG的发病机制提供新的理论支持,为新的治疗方法提供潜在靶点。方法:1、(1)使用Western blot方法检测患者的selleck GW4869房水、小梁网、巩膜和角膜细胞中的血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)蛋白表达情况;(2)收集POAG和白内障患者的房水,使用人AngⅡELISA试剂盒检测房水中AngⅡ的浓度,非接触电子眼压计测量眼压,统计分析眼压与AngⅡ浓度的关系;2、原代与转化HTMCs的培养与鉴定:使用人眼小梁网组织块贴壁培养法进行原代培养;含或不含有400n M地塞米松的培养液处理体外培养的HTMCs,免疫荧光染色检测肌纤蛋白(myocilin,MYOC)的表达进行鉴定。3、培养的原代HTMCs和转化细胞系,分别进行下列实验:3.1观察AngⅡ对小梁网ECM纤维化指标的影响。方法:实验分为2组,空白对照组、10μM AngⅡ组,分别处理转化和原代的HTMCs 48h后,采用Western blot和免疫荧光技术检测ECM纤维化指标:胶原蛋白1(collagen 1,Col1)、FN、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的蛋白表达水平,q PCR方法检测Col1、FN、α-SMA m RNA表达情况,并进行统计分析。3.2观察AngⅡ对HTMCs中ROS水平和NOX家族蛋白表达水平的影响。方法:实验分为2组,空白对照组、10μM AngⅡ,分别处理转化和原代的HTMCs 48h后,使用DCFH-DA荧光探针检测ROS的水平,q PCR方法检测两组HTMCs NOX1-5 m RNA的表达水平,Western blot检测NOX4蛋白水平的变化;3.3敲低NOX4对AngⅡ诱导ROS和ECM纤维化指标的影响。方法:HTMCs随机分为3组:空白对照组、AngⅡ、AngⅡ+NOX此网站4i,作用48h后,使用DCFH-DA荧光探针检测的水平,Western blot、免疫荧光方法检测NOX4、Col1、FN和α-SMA的蛋白表达水平。3.4 GLX351322,NAC两种抗氧化剂对AngⅡ诱导的ECM纤维化指标的影响。方法:实验分为4组:空白对照组、AngⅡ、AngⅡ+GLX351322(NOX4抑制剂,10μM)、AngⅡ+NAC(ROS清除剂,40μM),分别处理转化的HTMCs,48h后,使用DCFH-DA荧光探针检测ROS的水平,Western blot、免疫荧光方法检测各组Col1,FN和α-SMA的蛋白表达水平,并进行统计分析。3.5 AngⅡ对Smad3信号通路的影响。方法:(1)实验分为2组:空白对照、AngⅡ,Western blot检测AngⅡ对HTMCs中Smad3,p-Smad3蛋白表达的影响;(2)实验分为3组:空白对照、AngⅡ、AngⅡ+GLX351322,Western blot检测各组药物对Smad3,p-Smad3及ECM纤维化指标的影响;(3)实验分为3组:空白对照组、AngⅡ、AngⅡ+SIS3(Smad3抑制剂),Western blot检测各组细胞中Smad3、p-Smad3、Col 1、FN和α-SMA蛋白表达差异。4、动物实验:4.1观察NOX4抑制剂GLX351322对AngⅡ眼局部注射的小鼠眼压及眼前段小梁网组织中Col1,FN表达的影响。方法:建立动物模型;将小鼠分为对照(0.9%生理盐水)、AngⅡ、AngⅡ+GLX351322三组,使用非接触式电子眼压计监测的小鼠眼压。4周后,免疫组织化学染色鉴定小梁网组织中Col1,FN的表达情况,并对结果进行记录和统计分析。4.2观察Smad3抑制剂SIS3对AngⅡ眼局部注射的小鼠眼压及眼前段小梁网组织中Col 1,FN表达的影响。方法:建立动物模型;将小鼠分为对照(0.9%生理盐水)、AngⅡ、AngⅡ+SIS3三组,使用非接触式电子眼压计监测小鼠眼压的变化。4周后,免疫组织化学染色鉴定小梁网组织中Col1,FN的表达情况,并对结果进行记录和统计分析。结果:1、(1)患者的房水、小梁网细胞、巩膜细胞和角膜细胞均可表达AGT。(2)白内障组(28例)与POAG组(20例)患者房水中AngⅡ浓度分别为(27.67±50.63),(44.35±60.77)pg/ml,差异具有统计学意义(P<0.05);在POAG患者中,房水中的AngⅡ浓度与眼压呈正相关(R=0.422,P<0.05);2、DEX干预后,体外培养的转化小梁网细胞系及原代HTMCs中MYOC表达上调(P<0.05),HTMCs体外培养成功。3、AngⅡ干预后,小梁网中ECM纤维化指标Col 1、FN、α-SMA m RNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。4、与空白对照组相比,AngⅡ干预后HTMCs ROS水平显著增加;NOX1-5中NOX4 m RNA的表达明显增加(P<0.05);5、与单独加入AngⅡ相比,激光共聚焦显微镜观察到AngⅡ+NOX4i组ROS水平显著降低(P<0.05),Western blot、免疫荧光检测到敲低NOX4可显著抑制AngⅡ诱导ECM纤维化指标NOX4、Col 1、FN、α-SMA的蛋白表达(P<0.05)。6、与AngⅡ组相比,AngⅡ+GLX351322、AngⅡ+NAC组细胞中的ROS水平和ECM纤维化指标Col 1、FN蛋白表达水平显著降低(P<0.05);7、与对照组相比,AngⅡ导致HTMCs中Smad3的磷酸化水平显著增加(P<0.05),Western Blot结果显示GLX351322或SIS3可显著抑制AngⅡ诱导的p-Smad3、Col 1、FN、α-SMA表达上调(P<0.05),Smad3总蛋白含量基本不变(P>0.05)。8、对照组小鼠眼压波动在10～15mm Hg,生理盐水、AngⅡ、AngⅡ+GLX351322干预4周后,三组的眼压分别为(10.40±1.075)、(19.40±3.098)、(13.0±1.633)mm Hg,GLX351322显著抑制AngⅡ诱导的眼压升高,差异具有统计学意义(P<0.05);通过免疫组织化学染色结果证明GLX351322抑制AngⅡ诱导的小梁网组织Col1、FN的表达上调(P<0.05)。9、对照组小鼠眼压波动在10～15tissue biomechanicsmm Hg,生理盐水、AngⅡ、AngⅡ+SIS3干预4周后,三组的眼压分别为(10.80±1.229)、(19.30±2.359)、(13.40±0.843)mm Hg,SIS3显著抑制AngⅡ诱导的眼压升高,差异具有统计学意义(P<0.05);通过免疫组化结果证明SIS3抑制AngⅡ诱导的小梁网组织Col 1、FN的表达上调(P<0.05)。结论:1、POAG患者房水中的AngⅡ较对照组显著升高,且与眼压呈正相关。2、AngⅡ促进小梁网ECM的纤维化。3、AngⅡ通过上调NOX4介导氧化应激,激活Smad3,促进小梁网ECM的纤维化。