研究背景:脑胶质瘤是最常见的源于中枢神经系统的原发性颅内肿瘤。任何年龄均可发生脑胶质瘤,其中位生存期约为15个月。目前,临床上用于治疗脑胶质瘤的方法主要有手术切除、放射疗法、化学疗法等。但是为了保护正常的脑组织,手术切除很难保证肿瘤组织切除彻底。由于血脑屏障和脑肿瘤存在异质性和内在耐药性,而且化疗药物容易导致很多的副作用,因此化疗药物难以取得很好的治疗效果。放射治疗只能杀灭具有放射敏感性的细胞,并不能根治脑胶质瘤;而且对于呈浸润性生长和在正常放疗范围之外仍然存在的脑胶质瘤细胞,放射治疗无效。脑胶质瘤细胞容易产生辐射抗性,造成脑胶质瘤的复发。因此寻找可以辅助增强辐射或化疗对脑胶质瘤细胞损伤作用的方法迫在眉睫。雷贝拉唑属于第二代质子泵抑制剂,常用于治疗胃溃疡,近来被发现在治疗肺癌时具有提高化疗敏感性的作用。然而,雷贝拉唑是否可以用于治疗脑胶质瘤尚未可知。早期生长反应因子EGR1是一种多功能的转录因子,主要参与免疫反应和纤维化等过程,与癌症的进展和转移密切相关,可能参与癌症的增殖、迁移和侵袭等过程。MGMT是目前已知的唯一一种能修复O~6甲基鸟嘌呤损伤的甲基转移酶,在避免烷化剂引起的基因突变、细胞死亡和肿瘤的发生过程中发挥重要作用。患者MGMT的高表达可能是造成脑胶质瘤耐药的主要原因。有研究表明,EGR1的表达与MGMT启动子甲基化存在显著相关性,但具体机制尚未阐明。雷贝拉唑是否可以通过调控EGR1进一步作用于MGMT影响辐射或化疗对脑胶质瘤细胞的损伤作用,从而控制脑胶质瘤的进展的机制也有待进一步探究。研究目的:采用雷贝拉唑与辐射或者替莫唑胺联合处理的方式观察雷贝拉唑是否可以影响辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞U251和U87的损伤作用;探讨早期生长反应因子EGR1与MGMT基因之间是否存在靶向调控关系;探讨雷贝拉唑是否可以影响辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞的损伤作用及其可能作用机制。研究方法:1.采用GEPIA生物信息学网站分析多种肿瘤与癌旁组织中EGR1的表达情况;2.通过CGGA数据库分析EGR1和MGMT基因的表达与脑胶质瘤患者生存期之间的关系;3.采用CCK8实验检测不同浓度雷贝拉唑(0-400μM)、雷贝拉唑与辐射(U251:6 Gy;U87:4 Gy)、雷贝拉唑与替莫唑胺(U251:200μM;U87:200μM)处理对脑胶质瘤细胞增殖活力的影响;4.采用克隆形成实验检测不同浓度雷贝拉唑处理脑胶质瘤细胞克隆形成能力的变化;5.采用划痕实验和Transwell实验,观察不同浓度雷贝拉唑处理脑胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的变化;6.采用流式细胞术检测不同浓度雷贝拉唑(0-400μM)、雷贝拉唑与辐射、雷贝拉唑与替莫唑胺联合处理对脑胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的影响;7.采用慢病毒转染的方法转染EGR1过表达质粒至细胞中构建稳定转染细胞模型;8.采用PCR和Westefunctional symbiosisrn blot实验检测雷贝拉唑、雷贝拉唑与辐射联合、雷贝拉唑与替莫唑胺联合处理对脑胶质瘤细胞EGR1和MGMT基因m RNA和蛋白表达变化的影响;9.采用CHIP-q PCR实验验证EGR1与MGMT之间的靶向调控关系。研究结果:1.肿瘤组织中EGR1与MGMT的表达对肿瘤进展的影响通过GEPIA分析平台分析EGR1和MGMT的表达及其与患者生存时间的相关性,结果显示,多种肿瘤组织中EGR1和MGMT的表达高于癌旁组织;EGR1基因和MGMT基因的表达与肿瘤患者的生存呈负相关;EGR1基因和MGMT基因相对表达量较低的患者具有更高的生存率和更长的生存期。2.雷贝拉唑对脑胶质瘤细胞增殖能力和克隆形成能力的影响CCK8实验结果显示,随着雷贝拉唑浓度的增加及作用时间的延长,U251细胞和U87细胞的增殖活性均显著降低(P<0.05)。在雷贝拉唑浓度相同时,U251细胞的增殖活性显著低于U87细胞,提示U251细胞对雷贝拉唑更加敏感。克隆形成实验结果显示,随着雷贝拉唑浓度的增加,U251细胞和U87的克隆形成数量逐渐减少(P<0.001;P<0.001)。3.雷贝拉唑对脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响随着雷贝拉唑浓度的升高,雷贝拉唑对细胞迁移能力的抑制作用逐渐增强(P<0.01;P<0.001)。当雷贝拉唑作用24 h后,细胞的迁移能力得到显著抑制。随着雷贝拉唑浓度的升高,细胞的侵袭能力得到显著抑制(P<0.001;P<0.001)。4.雷贝拉唑对脑胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的影响采用流式细胞术检测不同浓度雷贝拉唑对U251和U87细胞凋亡和细胞周期改变情况。当处理浓度为200-400μM时,与对照组相比,U251细胞凋亡率显著升高(P<0.01;P<0.05;P<0.001)。只有处理浓度为400μM雷贝拉唑处理细胞时,与对照组相比,U87细胞的凋亡率增加才具有显著性(P<0.05)。雷贝拉唑的浓度为100和200μM时,与对照组相比,处于S期的U251细胞百分率显著升高(P<0.01);雷贝拉唑的浓度为300μM时,与对照组相比,处于G_0/G_1期的U251细胞百分率显著升高(P<0.05);雷贝拉唑的处理浓度为100μM时,与对照组相比,处于G_0/G_1期的U87细胞百分率显著升高(P<0.01);浓度为300购买PUN30119μM时,与对照组相比,处于G_2/M期的U87细胞百分率显著升高(P<0.01)。提示雷贝拉唑浓度为100和200μM时,U251细胞发生S期延迟;浓度为300μM时,U251细胞发生G_0/G_1期阻滞;雷贝拉唑浓度为100μM时,U87细胞发生G_0/G_1期阻滞;浓度为300μM时,U251细胞发生G_2/M期阻滞。5.雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞损伤作用的影响CCK8实验结果显示,雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺后细胞的增殖活性显著低于单独雷贝拉唑、单独辐射或单独替莫唑胺处理组(P<0.01);流式细胞术分析结果显示,雷贝拉唑联合辐射或替莫唑NSC 125973采购胺后细胞凋亡率显著高于单独雷贝拉唑、单独辐射或单独替莫唑胺处理组(P<0.01_((Rabe+Radiation,U251));P<0.01_((Rabe+Radiation,U87)));P<0.01_((Rabe+TMZ,U251));P<0.01_((Rabe+TMZ,U87)))。提示雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞的损伤作用显著增强。与单独辐射处理相比,U251细胞接受雷贝拉唑和辐射联合处理后S期细胞的百分率显著升高(P<0.001)。与单独替莫唑胺处理相比,U251细胞接受雷贝拉唑和替莫唑胺联合处理后G_2/M期细胞的百分率显著升高(P<0.01)。与单独接受辐射处理相比,U87细胞接受雷贝拉唑和辐射联合处理后G_2/M期细胞的百分率显著升高(P<0.01)。与单独接受替莫唑胺处理相比,U87细胞接受雷贝拉唑和替莫唑胺联合处理后S期细胞的百分率显著升高(P<0.01)。提示雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺使U251细胞分别发生S期延迟和G_2/M期阻滞;雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺使U87细胞分别发生G_2/M期阻滞和S期延迟。6.雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞EGR1和MGMT表达的影响PCR和Western blot实验结果显示,与对照组相比,雷贝拉唑联合辐射或替莫唑胺处理后细胞的EGR1和MGMT基因的m RNA(P<0.01_((EGR1,U251));P<0.001_((MGMT,U251));P<0.001_((EGR1,U251));P<0.01_((MGMT,U87)))和蛋白(P<0.01)表达均显著降低。提示雷贝拉唑可能通过抑制EGR1/MGMT增强辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞的损伤作用。7.EGR1与MGMT之间靶向调控情况CHIP-q PCR实验结果证实,EGR1可与MGMT基因启动子结合。研究结论:1.雷贝拉唑可以降低U251和U87细胞的增殖活性、克隆形成能力、迁移和侵袭能力;促进U251和U87细胞凋亡;低浓度雷贝拉唑促使U251细胞发生S期延迟;高浓度雷贝拉唑促使U251细胞发生G_0/G_1期阻滞;低浓度雷贝拉唑促使U87细胞发生G_0/G_1期阻滞;高浓度雷贝拉唑促使U251细胞发生G_2/M期阻滞;2.辐射或替莫唑胺联合雷贝拉唑可以进一步抑制U251和U87细胞的增殖活性;进一步促进U251和U87细胞凋亡;雷贝拉唑联合辐射分别促使U251和U87细胞发生S期延迟和G_0/G_1期阻滞;雷贝拉唑联合替莫唑胺分别促使U251和U87细胞发生G_0/G_1期阻滞及S期延迟;3.EGR1可与MGMT基因启动子结合,从而促进MGMT的表达;雷贝拉唑可能通过抑制EGR1/MGMT增强辐射或替莫唑胺对脑胶质瘤细胞的损伤作用。