靛蓝是目前已知最古老的色素之一,广泛用于印染行业、医药学和食品领域。靛蓝绿色制备工艺的开发对社会、环境的发展均具有重要意义。本课题利用化学干预策略与蛋白工程技术结合的方式,基于细胞色素P450BM3单加氧酶开发H_2O_2依赖型人工过氧化物酶,催化吲哚羟基化反应制备靛蓝。该人工过氧化物酶体系组分简单,不依赖电子传递蛋白和辅酶NAD(P)H,具有优异的生物催化性能,为靛蓝制备提供了绿色生产的替代方法。具体内容如下:P450BM3蛋白突变体文库构建与突变体制备。通过理性设计选定了78、87和268三个突变位点,其中,78号氨基酸位于底物通道且距离蛋白活性中心较近;87号氨基酸位于活性中心处底物进出通道末端;268号氨基酸位于反应活性口袋I螺旋纽结区域。通过基因定点突变构建了F87A、F87G、F87A/T268A、F87A/T268I、F87A/T268V、F87G/T268A、F87G/T268I、F87G/T268V、V78A/F87A、V78A/F87G等10个细胞色素P450BM3的突变体文库;通过菌液测序确定突变体文库构建成功。P450BM3蛋白的表达与纯化。以大肠杆菌为载体对突变体文库进行蛋白的表达、培养与纯化。加入IPTG诱导蛋白表达、超声破碎、亲和层析、透析浓缩得到目的蛋白;SDS-PAGE蛋白凝胶电泳显示单一条带,分子量约为55 k Da;P450BM3的紫外可见光谱在450 nm处呈现P450酶的特征吸收峰。P450BM3对吲哚羟基化反应的催化能力测试。分别对反应温度、p H、H_2O_2浓度、双功能小分子结构进行优化,确定最优反应条件为温度37℃,p H8.0,H_2O_2浓度30 m M,选择双功能小分子咪唑基乙酰苯丙氨酸(Im-C6-Phe)。蛋白催化性能测试结果表明,野生型P450BM3不能催化吲哚羟基化反GSK1120212采购应,其87号位置苯丙氨酸(Phe)的苯环阻碍底物进入,将其替换丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)后蛋白催化效率大幅提升,F87A和F87G突变体的k_(cat)分别为1007 min~(-1)和1304 min~(-1)。此外,268位置的极性氨基酸苏氨酸(Thr)突变为非极性的丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)后,P450BM3的K_m值显著降低,表明疏水口袋的构建有利于底物和血红素中心的结合。双突变体F87G/T268A的催化效率k_(cat)/K_m高达1388 m M~(-1) min~(-1),是肌红蛋白双突变体F43Y/H64D(k_(cat)/K_m=11.86 m M~(-1) min~(-1))的117倍;神经红蛋白三突变体A15C/H64D/F49Y(k_(cat)/K_m=43.25 m M~(-1) min~(-1))的32倍。除此之外,78、87、268位置氨基酸的排布变化能够改变活性口袋的大小与极性,进而影响底物的选择性以及产率,F87A/T268V催化吲哚羟基化反应的化学选择性为80%,双突变体F87G/T268V催化吲哚羟基化制备靛蓝的产率为73%。催化机制解析。利用紫外E-616452使用方法可见光谱(UV-Vis)、高效液相色谱(HPLC)、超高效液质连用色谱(UPLC-MS)以及核磁共振氢谱(~1H NMR)等鉴定反应代谢物,阐明P450BM催化吲哚羟基化反应的催化机制。P450BM3与双功能小分子、吲哚的分子对接模拟结果表明,吲哚不能进入野生型P450BM3的活性部位,因此野生型P450BM3不具备催化活性;P450BM3突变体F87A/T268V、F87G/T268A、F87G/T268V与双功能小分子Video bio-logging、吲哚的对接结果显示,吲哚3号位置碳原子与血红素铁中心的距离均为最近距离,分别为6.98?、6.20?和6.84?,易于反应进行,与推测的反应机理一致。P450BM3对吲哚氯代衍生物的羟基化反应的测试。分别优化不同吲哚氯代物的最适反应条件,测定野生型P450BM3及10种突变体催化吲哚衍生物羟基化反应的效率。结果表明,野生型P450BM3不能催化吲哚氯代物的羟基化反应;F87A突变体催化4-氯吲哚羟基化的转化率最高,达到63%;F87G突变体催化5-氯吲哚羟基化的转化率最高,达到84%;F87G、V78A/F87A突变体催化6-氯吲哚羟基化的转化率最高,均达到98%;V78A/F87G突变体催化7-氯吲哚羟基化的转化率最高,达到67%。