研究背景:雄激素性脱发(AGA)是以头皮毛囊微小化为特征的一种常见的皮肤科疾病,不仅严重影响患者的生活质量,部分selleck化学患者还要面临治疗药物带来的副作用。AGA的发病机制可能和雄激素代谢相关,睾酮(TS)在5α-还原酶的作用下转化为二氢睾酮(DHT),DHT与毛囊细胞中的雄激素受体(AR)结合进而导致脱发。目前AGA治疗方式包括口服非那雄胺(FNS)、度他雄胺(DUT),外用米诺地尔(MXD)等。其中DUT对5α-还原酶的抑制作用优于FNS,但口服DUT可能导致患者出现男性乳房发育、睾丸疼痛和性功能受损等副作用。而外用MXD可能造成脱屑、瘙痒等不良反应。所以我们尝试新型可控的给药方式,如将口服DUT改为局部给药,减少因全身给药引起的不良反应。此外,靶向AR的药物同样是研究热点。siRNA作为一种特异性基因沉默工具可以靶向敲低目的基因,却因系统循环稳定性差、生物膜渗透性低,限制了应用。因此,需要合适的载药系统共同递送药物和siRNA,达到双重靶向治疗的效果。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)因具有良好的生物相容性、低毒性、可生物降解等优势,常被用作递送药物的纳米载体。细胞膜伪装技术可用于修饰纳米粒子(NPs),使NPs获得了细胞膜所特有的功能和性质,提高生物相容性及靶向性。研究目的:本研究旨在通过仿生纳米载药系统共递送DUT以及针对AR的siRNA(siAR),以局部给药的方式双重靶向治疗AGA,从而达到使毛乳头细胞(DPC)增殖,促进毛发生长的效果,并减少口服DUT所带来的副作用。研究方法:1.DPC的分离、培养及鉴定:显微解剖法结合一步酶消化法进行DPC的分离、提取。通过以下方法进行DPC的鉴定:观察细胞形态,成骨、成脂诱导分化,特异性碱性磷酸酶染色,流式细胞术检测DPC对间充质干细胞标志物的表达,Western blot、RT-PCR、免疫荧光技术对DPC特征性标志物进行鉴定。2.PLGA-DUT/siAR@DPCMNPs 的制备及表征:W/O/W 复乳法制备 PLGA-DUT/siAR NPs;膜挤压法合成毛乳头细胞膜(DPCM)伪装的共载DUT以及siAR 的 PLGA 纳米粒子(PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs)。RT-qPCR 方法对三条备选siAR的敲除效果进行评估,用于确定敲除率最高的siAR。动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)检测 PLGA-DUT/si AR NPs 以及 PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs粒径、电位及形貌。检测纳米粒子中DUT含量,计算DUT载药量和包封率,确定最佳投入比例;检测纳米粒子上清液中siRNA含量,计算siRNA的载药量及包封率。SDS-PAGE凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色鉴定细胞膜裂解物及PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs的蛋白质分布。体外释放实验检测不同时间点释放介质中DUT的含量,判断PLGA-DUT NPs以及PLGA-DUT@DPCM NPs体外释放的情况。使用激光共聚焦显微镜(CLSM)进行共定位检测。3.体外实验:CCK8法检测 PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs对DPC增殖作用。流式细胞术、CLSM分别观察DPC对PLGA-FITC NPs和PLGA-FITC@DPCM NPs的摄取情况。Western blot及RT-qPCR检测AR基因沉默效率。皮肤渗透与保留实验中,检测PLGA-DUT NPs及PLGA-DUT@DPCM NPs组在不同时间点,接收室、角质层、毛囊及皮肤组织中的DUT含量。4.体内实验:皮下注射TS构建AGA小鼠模型,分组治疗后通过直观观察及组织病理学检测评估毛发覆盖率、密度和直径;毛发生长指数评估毛发生长情况。对AGA小鼠皮肤组织进行免疫荧光检测来判断目的基因AR的体内沉默效果。体内皮肤渗透实验观察纳米粒子在皮肤中的渗透情况。对主要脏器的组织病理学检测评估纳米粒子安全性。对皮肤组织中Bcl-2、TGF-β2行免疫荧光检测,评估不同组别的毛囊细胞凋亡情况;对皮肤组织中Wnt3a、β-catenin、MMP3行免疫荧光检测,探索毛囊生长相关机制。研究结果:1.DPC的分离、培养及鉴定:成功提取DPC,细胞成活率高,可以正常培养、传代。成骨、成脂诱导分化实验中分别出现矿盐沉积结节以及圆又大的脂滴,对应的染色检测结果均为阳性。随着DPC传代次数增高,碱性磷酸酶染色变浅,DPC活力变低。DPC表达间充质干细胞标志物CD73、CD90、CD105,且表达 DPC 特征性标志物 SOX2、ALP、Versican、α-SMA、Nestin。2.纳米粒子的制备及表征:成功制备PLGA-DUT/siAR NPs和PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs。PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs 形态为均匀分布的核-壳结构;PLGA-DUT/siARNPs 和 PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs 的平均直径分别为157.23 ± 1.16 nm 和 194.83± 3.18 nm;Zeta 电位检测中,PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs与细胞膜囊泡的电位相似。当DUT投入量为0.8mg,PLGA 10mg时,药物包封率较高,达到53.31±0.64%,载药量为6.45±0.12%,纳米粒子中siRNA的包封率为47.1±0.3%,载药量为21.2±0.2μg/10mg。筛选出siAR-2843对目的基因敲除率最高。SDS-PAGE凝胶电泳后染色观察到DPC细胞膜囊泡ICU acquired Infection和PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs具有相似的蛋白质分布。共定位实验可以观察到DPCM、FITC、siRNA三者之间荧光区域重合。体外释放实验PLGA-DUT NPs 累积释放量约 57.35±1.84%,高于 PLGA-DUT@DPCM NPs 的累计释放量(40.54±1.77%)。3.体外实验结果:CCK8实验中,PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs组显示出最高的细胞活性。流式细胞术及CLSM结果均观察到PLGA-FITC@DPCM NPs在两个Imidazole ketone erastin纯度检测时间点的摄取效率高于PLGA-FITC NPs。PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs有良好的基因沉默效率。在渗透与保留实验中,PLGA-DUT NPs组及PLGA-DUT@DPCM NPs组在6h和12h,角质层中的DUT含量相似;PLGA-DUT@DPCM NPs组在6h和12h时在毛囊和皮肤中检测出比PLGA-DUT NPs组更高的DUT含量。4.体内实验结果:PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs组和阳性对照组在直观观察及病理检测中均显示理想的毛发覆盖率、密度和直径,同时有较高的毛发增长指数。免疫荧光染色观察到实验组对AR有明显的敲低效果。体内皮肤渗透实验中荧光已到达真皮层,经过荧光标记的NPs分布在毛囊及周围。主要脏器的组织病理学检测中未观察到明显损伤。另外,免疫荧光观察到PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs组中Bcl-2的表达高于模型组,而TGF-β2表达极少。PLGA-DUT/siAR@DPCMNPs 组中 Wnt3a、β-catenin、MMP3 的荧光强度均高于模型组。研究结论:1.成功分离、培养、鉴定并扩增DPC,利用其制备DPCM,并合成DPCM伪装的共载药物和基因沉默工具的纳米粒子PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs。2.PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs在细胞水平上能被更高效地摄取,缓释后达到促进DPC增殖的效果,且无细胞毒性,可以有效降低DPC中AR表达,同时具有良好的毛囊靶向能力。3.PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs作为一种体外涂抹的药物,可以到达毛囊及周围组织,同时降低给药频率,对AGA动物模型有良好的促进毛发生长的效果。PLGA-DUT/siAR@DPCM NPs可以抑制毛囊细胞凋亡,促进毛发进入生长期,并通过上调Wnt/β-catenin通路发挥作用。