化学全合成在药物以及复杂的天然产物的合成方面已经取得了巨大成就,但是仍然存在诸多挑战性问题,例如化学反应试剂昂贵、反应条件苛刻、合成路线冗长且对环境污染严重等。与许多化学催化反应相比,酶促反应通常涉及的温度和压力比较温和,有助于将多个步骤合并为一锅工艺去进行催化合成,而生物正交化学的发展为生物催化中的多酶固定化提供了更多的方法与可能。本研究通过将参与级联反应的两种酶(醛酮还原酶和醇脱氢酶)有序“涂覆”在载体表面,使酶与酶空间上邻近,形成底物通道,从而增强双酶的协同作用和催化效率。首先,对Spy Tag/Spy Catcher在酶蛋白连接方面的应用进行了探究。使用酪氨酸氨解酶(Tyrosine ammonia lyase,TAL)作为模型酶,并在其两端分别融合Spy Tag与Spy Catcher,使Spy Tag-TAL-Spy Catcher可以通过Spy Tag与Spy Catcher的特异性反应自交联形成交联酶聚集体TAL-CLEs。实验结果表明,所制备酶聚集体TAL-CLEs催化产率达98.31%,是基于戊二醛交联的酶聚集体催化产率(23.71%)的4.15倍。在90℃孵育15 min仍能保持50.38%的初始活性,且重复催化6次后目标产物对香豆酸的产率仍能保持初始的70.13%,说明使用Spy Tag和Spy Catcher作为连接方式对酶蛋白的影响是温和的,不仅对酶活力影响较小,而且具有较高的反应速率,较好的特异性以及稳定性,是一种适用于酶蛋白特异性连接的生物正交方式。其次,将Spy Tag/Spy Catcher系统应用在双酶级联催化反应中,构建醛酮还原酶(Aldo-ketoreductase,AKR)与醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)的双酶有序“涂层”级联催化体系。将Spy Catcher与Spy Tag分别与AKR和ADH融合,构建融合蛋白Spy Catcher-AKR和Spy Tag-ADH,使AKR与ADH能够通过Spy Catcher与Spy Tag进行交联。为了能够将两种酶有序“涂覆”在载体上,在酶蛋白中插入了非天然氨基酸(4-叠氮基-L-苯丙氨酸),通过酶蛋白上的叠氮基与载体上的炔基发生点击化学反应将酶固定在载体上,另一种酶蛋白通过Spy Tag与Spy Catcher的自发反应与被固定的酶进行交联,以此达到了将双酶有序“涂覆”的效NSC 125973果。最后,将有序双酶“涂层”应用于(R)-1-(2-氯苯基)乙醇的催化合成。实验结果表明,有序双酶涂层@ADH-AKR的催化产率达到80.75%,而且ee值均高于99.99%,在经过了5次循环实验之后,有序双酶涂层@ADH-AKR催化反应保留了初始产率的71.01%,高于无序固定(63.11%),说明将AKR与ADH进行有序涂层是一种高效的固定化方式,使底物在酶蛋白之间更高效的流通,不bacteriochlorophyll biosynthesis仅可重复性较好,同时有较高的催化效率。此外,将酶蛋白进行两层“涂覆”,也意味着与普通的酶蛋白单层固定相比,相同量的载体可以固定更多的酶蛋白,大大节约了资源和成本,符合绿色可持续发展策略。综上所述,通过生物正交的方式将参与级联反应的双酶进行有序“涂覆”,确定了一种更加高效的多酶有序固定化方式。将Spy Tag/Spy Catcher系统应用于PEG300TAL酶蛋白的自组装,验证了Spy Tag/Spy Catcher作为生物正交方式在酶蛋白交联中的高效应用。在此基础上,将Spy Tag/Spy Catcher应用在双酶的有序“涂覆”中,并与非天然氨基酸相结合,构建了一种固定在多孔载体上的有序双酶“涂层”,应用于催化合成手性醇类药物中间体。