在玉米生产中,由拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是玉米上的主要病害之一,该病不仅影响玉米的品质和产量,病原菌产生的伏马毒素对人和牲畜也有较强的毒害作用。目前对穗腐病的防治主要以化学防治和种植抗病品种为主,但是过量喷施化学杀菌剂不仅导致病菌产生耐药性,从而降低防治效果,同时药剂对环境的危害也引起了人们的普遍关注;另一方面,抗病品种的选育周期长,生产中抗镰孢菌的玉米资源匮乏,也不能满足育种需求。因此,明确拟轮枝镰孢致病和玉米抗病机制及其互作过程,探索防治玉米穗腐病新策略、新途径显得尤为重要。miRNA(植物中为miRNA,真菌中为milRNA)是一类内源性非编码的短链小分子RNA,在转录或转录后水平调控内源基因或跨界调控靶基因的表达,参与植物和病原菌的互作。近年来,随着真菌milRNA的发现和植物miRNA的生物学功能被深度解析,对拟轮枝镰孢致病milRNA的挖掘和玉米抗病miRNA的机理研究显得尤为迫切。本研究以拟轮枝镰孢和玉米互作的样品为试验材料,对其进行小RNA测序(sRNA-seq)、降解组测序和转录组测序(RNA-seq),挖掘并筛选互作过程中差异表达的miRNA及其靶基因。本研究通过qPCR、烟草共转化和5′ RLM-RACE试验明确了 miRNA及其靶基因之间的调控关系。筛选得到了同时可以靶向拟轮枝镰孢和玉米内源基因的玉米miR528b-5p,并鉴定得到了互作过程中拟轮枝镰孢产生的milRNA。利用分子生物学、遗传学、生物化学、植物病理学等研究手段,明确了 miRNA参与拟轮枝镰孢致病和玉米抗病过程,解析了作用机理,为玉米穗腐病防治新策略、新方法提供理论基础。主要研究结果如下:1.通过测定拟轮枝镰孢侵染玉米不同时期的小RNA,鉴定得到了参与玉米和拟轮枝镰孢互作的miRNA。共得到51个拟轮枝镰孢milRNA,284个玉米已知miRNA和6571个新的miRNA,其中28个玉米miRNA差异表达。2.筛选到了拟轮枝镰孢侵染玉GSK1120212半抑制浓度米及玉米抵抗病菌侵染的相关基因并明确了两者的互作过程。通过对拟轮枝镰孢和玉米互作0、4、12和72 h的样品进行转录组测序及生物信息学分析,发现拟轮枝镰孢在侵染早期主要局限于玉米的细胞间隙生长,早期侵染触发了玉米Ca2+信号通路和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)爆发selleck产品,病菌侵染后期继续在籽粒中定殖及扩张,而玉米主要通过MAPK信号通路、植物-病原互作和植物激素信号转导等途径参与抵御病原菌侵染。3.明确并验证了玉米miRNA跨界调控拟轮枝镰孢,通过靶向病菌中的致病相关基因表达调控真菌致病。本研究筛选到8个玉米已知差异miRNA跨界靶向13个拟轮枝镰孢基因,17个差异表达的新的玉米miRNA靶向458个拟轮枝镰孢基因。人工合成玉米差异miRNA ds-miR528b-5p和ds-miR171h-3p,喷施玉米后玉米籽粒病斑面积减少,靶基因表达量降低,表明miRNA参与了抗病过程。qPCR分析发现,miRNA与靶基因表达趋势相反。利用烟草共转化试验验证了 miR528b-5p与F VEG 02035,miR408b-3p与FVEG 02164,miR171h-5p 与 FvEG_09695 之间存在负调控关系;利用降解组和5′ RLM-RACE试验鉴定到miR528b-5p在FVEG_02035中的切割位点,表明两者存在互作关系。4.miR528b-5p通过靶向拟轮枝镰孢编码2次跨膜蛋白FvTTP(FVEG_02035)基因的表达抑制病原菌侵染。通过结构域分析和亚细胞定位试验发现,FVEG_02035蛋白含有2次跨膜结构域,定位在细胞膜。利用原生质体转化试验获得FvTTP基因敲除和回补菌株,对其进行表型分析和致病性试验,发现FvTTP缺失后影响菌丝分隔长度、分生孢子产生数量、伏马毒素(FB)产生能力和致病性,但不影响菌丝生长、细胞壁完整性和细胞壁降解酶的活性。接种ΔFvTTP菌株的玉米水杨酸(SA)含量和PR1基因表达量显著高于对照处理。5.筛选得到miR528b-5p靶向抑制内源ZmRING-PHD基因的新转录本PEX的表达,提高玉米抗病能力。通过降解组从28个差异表达的miRNA中筛选得到10个玉米差异miRNA可靶向108个玉米内源mRNA,通过对靶基因进行功能预测,发现靶基因主要参与ABC转运、氨基酸生物合成、酪氨酸代谢,过氧化物酶体和自噬等过程。通过烟草共转化试验明确了 miR528b-5p与ZmRING-PHD(Zm00001 d047676)和miR408b-3p与Zm00001d041236的负调控关系,利用降解组和5′ RL M-RACE试验鉴定到miR528b-5p在ZmRING-PDH新转录本PEX中的切割位点,外源施加ds-miR528b-5p后,籽粒病斑面积减少,ZmRING-PHD_PEX下调表达,其它已知T1、T2和T3转录本上调表达。拟轮枝镰孢侵染导致ZmRING-PHD_PEX表达量降低,而其它已知转录本的表达量增加。得到ZmRING-PHD转座子插入突变体,该突变体中所有转录本均下调表达,但是对T2和T3的影响更大,致病性试验显示突变体对病原菌更敏感,更易感病。接种拟轮枝镰孢后,B73中PR基因表达量较ring-phd突变体高。6.首次在拟轮枝镰孢中鉴定得到milRNA,发现milRNA依赖FvDicer-2产生并通过负调控靶基因参与真菌致病。利用降解组筛选得到51个milRNA可靶向玉米333个基因,主要富集在植物激素信号转导和植物病原互作、MAPK信号途径、mRNA监测途径、糖酵解/糖异生、剪接体、丁酸代谢等途径。Stem-loop qPCR检测到互作样品中milRNA与其靶基因表达趋势相反。通过原生质体转化的方法创制得到参与milRNA生物合成的FLiver hepatectomyvDicer2基因缺失和回补菌株,FvDicer2基因的缺失降低了病菌的致病能力,影响了 milRNA的产生,玉米中其相应靶基因表达上调。以上结果表明,拟轮枝镰孢milRNA的合成依赖FvDicer2并负调控其在玉米中的靶基因。