PM2.5是造成全球大气污染的重要污染源,尽管其在地球大气组分中占比较低,但因其包含多种毒性成分、在空气中滞留时间久、输送距离远等特点,能够增加急性肺损伤(ALI)、慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)等多种呼吸系统疾病的发病率或死亡率。在细胞层面,PM2.5导致ALI的机制十分复杂,涉及多种细胞死亡方式和信号通路的改变。近期有研究报道PM2.5能够通过诱导内皮细胞氧化应激和铁超载导致细胞发生铁死亡,然而PM2.5是否能够通过诱导细胞铁死亡导致ALI及其分子机制尚不明确,需要进一步研究。方法:本实验主要包括两部分:第一部分主要体外构建PM2.5诱导的ALI模型,确立铁死亡在PM2.5诱导ALI中的主要作用。我们选取支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)作为研究对象,制备不同浓度的PM2.5有机萃取溶液,与细胞共培养后检测细胞活性、脂质过氧化、铁离子水平以及铁死亡特征性蛋白的表达水平,阐明PM2.5体外诱导ALI的毒理作用。第二部分在第一部分实验的基础上,探究PM2.5诱导铁死亡发生的具体分子机制,应用分子生物学(敲低、过表达、q PCR)、免疫学(Western Blot、免疫共沉淀)等方法探究铁死亡发生时AMPKBeclin1信号通路起到的主要作用,阐明PMGenetics education2.5通过激活AMPK-Beclin1信号通路促进细胞铁死亡的分子机制。另外,本实验使用PM2.5滴鼻方式诱导小鼠体内ALI模型,通过体内实验证实PM2.5激活AMPK-Beclin1信号通路诱导铁死亡导致小鼠ALI的新机制。结果:1、在体外,PM2.5以剂量依赖性方式导致细胞活性下降、脂质过氧化增强、铁死亡相关蛋白表达紊乱,具体表现为铁贮存蛋白(FTH-1、FTL)和铁内向转运蛋白(TFR)表达增强、铁外向转运蛋白(FPN)表达减弱、脂质过氧化蛋白(COX-2、NOX-4)表达增强、铁死亡特征性蛋白(氨基酸转运蛋白x CT/SLC7A11)表达受抑制。铁死亡抑制剂(DFO、Fer-1)能够部分缓解PM2.5造成的细胞活性下降,减轻脂质过氧化水平,降低不稳定铁和稳定铁水平。2、PM2.5造成铁死亡过程中,AMPK-Beclin1信号通路被激活,SLC7A11的表达被抑制。敲低Beclin1后,PM2.5触发的铁死亡被抑制,表现为脂质过氧化和铁超载程度下降,细胞活性较非敲低组明显升高。体内实验显示敲低Beclin1可以改善肺损伤,使炎症水平下降。过表达Beclin1后,显示出与敲低相反的结果,即脂质过氧化水平和铁超载水平较对照组加重,细胞活性下降,小鼠肺损伤程度更严重。免疫共沉淀结果显示Beclin1通过直接与SLC7A11结合,抑制System XC-活性,导致转运进入细胞的胱氨酸减少,GSH合成不足,导致铁死亡发生。同样,给予AMPK抑制剂Compound C和激活剂AICAR,通过影响AMPK活性来调控Beclin1表达,与上述敲低和过表达Beclin1显示出相似的实验结果。这些结果表明AMPK-Beclin1信号通路在促进PM2.5诱导的铁死亡中起到重要作用。实时荧光定量PCR结果证实低剂量PM2.5激活SLC7A11的转录,高剂量时轻度抑制其转录,表明System XC-的活性抑制主要发生在蛋白质水平,而非转录水平。3、在体内,PM2.5造成明显的肺部病理损伤,表现为肺泡内液体渗出、水肿、大量炎性细胞浸润;肺组织铁沉积增多;线粒体皱缩变圆、膜增厚、嵴破坏。肺泡灌洗液姬姆萨染色显示中性粒细胞和淋巴细胞大量浸润聚集;ELISA结果表现为炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平显著升高。铁贮存蛋白(FTH-1)表达增强、铁死亡特征性蛋白(SLC7Belnacasan小鼠A11)表达受抑制。使用AAV-sh RANBeclin1体内敲低Beclin1,结果发现小鼠肺部损伤和炎症水平有所减轻,线粒体损伤得到缓解,铁超载和脂质过氧化也相应减轻。相似的,体内腹腔注射AMPK抑制剂Compound C后,抑制下游Beclin1的表达,与体内敲低Beclin1表现出相似的结果。4、Beclin1与自噬密切相关,但自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)仅轻度逆转了PM2.5造成的细胞存活率下降,而脂质过氧化和铁超载程度未见显著缓解。PM2.5能够激活自噬,自噬抑制剂阻断自噬流,但并没有抑制铁死亡发生,表明PM2.5激活Beclin1主要通过诱导铁死亡导致ALI,并非自噬。结论:综VX-661体内实验剂量上所述,本研究探究了AMPK-Beclin1信号通路介导的铁死亡在PM2.5诱导的ALI中的作用及其分子机制,为理解PM2.5对呼吸系统疾病的毒理作用提供新思路,为肺损伤的治疗提供新靶标。