CRISPR(Clustered regularly interspersed short palindromic repeats)技术的出现,大大提高了基因组编辑的准确性,并且有助于更好地诊断、预测疾病,以及更有效地实施基因治疗。基于腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器,不同的科学家研制了一种新型双碱基编辑器,它能够有效地实现C-to-T和A-to-G的编辑。然而,许多人类遗传疾病是由在同一基因组位点上的多核苷酸变异引起的。而在同一等位基因上尚未开发出同时实现C&G-to-T&A和A&T-to-G&C转换的理想工具。本文提出了 一种碱基编辑器与双sgRNA(single guide RNA,sgRNA)相结合的策略,针对DNA双链上重叠的相邻两个位点,在重叠的靶向窗口内同时诱导C&G-to-T&A和A&T-to-G&C转换。研究结果如下:1.双sgRNA策略促进了小型目标窗口中并发的C&G-to-T&A或A&T-to-G&C转换,利用BE4max和ABEmax可精确突变HEK293T细胞中不同基因的目标位点,且没有副产物。根据HEK293T细胞中的目标位点设计了一对分别针对正义链和反义链的sgRNA(sg-L和sg-R),并设置了重叠的靶向窗口(单条间隔序列的4-8位;至少2-nt重叠);分别将单条gRNA和一对sgRNA与BE4max和ABEmax共同转染进HEK293T细胞。Sanger和深度测序结果显示,有七个位点在双sgRNA的引导下能够利用BE4max实现C&G-to-T&A的目标突变,有三个位点能够利用ABEmax实现A&T-to-G&C的目标突变。2.双sgRNA策略促进在同一条DNA链上同时实现C&G-to-T&A或A&T-to-G&C双碱基转换。考虑到C&G-to-T&A或A&T-to-G&C编辑可能同时发生在不同的等位基因上,将一对sgRNA克隆到由两个独立的人类U6启动子驱动的单一表达载体上,命名为2U6。与原始策略相比,在2U6驱动的双sgRNA引导下BE4max和ABEmax对目标位点的编辑效率略高。Sanger和深度测序结果显示对于大多数测试位点,2U6组中包含并发C&G-to-T&A或A&T-to-G&C转换的测序reads(读长)的百分比显著高于双载体组而Indels(插入和删除)比例并没有显著增加。3.对双sgRNA系统进行进一步改良,以提高同一等位基因的并发编辑效率。通过对其中一个配对的gRNA进行突变(与经过另外一条gRNA编辑的序列能够完美匹配),构建改良版的2U6,命名为2U6mut,可有效地促进同一等位基因上的碱基转换。Sanger和深度测序结果表明,BE4max和ABEmax在2U6mut驱动的sgRNA引导下的编辑效率与2U6相当或略高,同时大多数测试位点中2U6mut组中包含并发C&G-to-T&A或A&T-to-G&C转换的测序readsdisc infection的百分比显著高于双载体组而Indels 比例没有显著增加。4.利用SpRY介导的碱基编辑器,扩大了双sgRNA策略的靶向范围。根据我们的设计,在双sgRNA系统中,目标序列必须两侧有“CCN”和“NGG”PAM(protospacer adjacent motif,原间区相关基序)序列,在人类基因组中靶向的范围非常有限。因此,将PAMless SpRY Cas9n与胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器融合,命名为SpRY-BE4max和SpRY-ABE8e可以极大地扩展潜在的靶向范围,覆盖多达90%的人类基因组。根据SpRY Cas9n的首选PAM序列“NRN”(R=G/A),采用2U6和2U6mut sgRNA策略分别检测SpRY-BE4max和SpRY-ABE8e在EMX1上的三个靶点,在目标窗口内同时发现了有效的 C-to-T 和 G-to-A,以及 A-to-G 和 T-to-C 转换。5.双sgRNA策略与双碱基编辑器相结合实现更为复杂多样的饱和突变。传统的双碱基编辑器只能引起C-to-G和A-to-T的转换,将双sgRNA策略与双碱基编辑器结合可以催化更复杂的突变类型。使用CABE-RY测试“CCN”和“NGG”PAM的四个位点以及4个“非NGG”PAM的位点。在较宽的靶向窗口内(从sg-L开始10-23 nt),观察到了相对较高的C-to-T、A-to-Gselleck产品、G-to-A和T-to-C转换,说明两种系统联用可大幅增加碱基变换的多样性。深度测序分析表明,可观察到多达三种不同类型的碱基转换的测序reads并且诱导产生的Indels率通常小于5%,这在生物医学和植物工程或饱和突变筛选中是可以接受的。6.双sgRNA策略用于多核苷酸变异致病突变模PCI-32765价格型。TP53是人类癌症中突变频率最高的基因之一,但是大部分突变的影响在很大程度上仍不清楚,其中包括一些突变已被确定为相邻区域的多核苷酸变异(Multi-nucleotide variant,MNV)。为了进一步解释MNVs 的功能意义,本文构建了两对 2U6mut sgRNA(sgTP53-2U6mut-1 和 sgTP53-2U6mut-2),分别使用 SpRY-ABE8e 和 SpRY-BE4max 诱导 L330P/Q331R 和R280K/R281Q/R283Y 突变;并且,从 sgTP53-2U6mut-1 和 SpRY-ABE8e 共转染的细胞中成功建立了含有L330P/Q331R突变的单个HeLa细胞克隆。通过细胞凋亡实验和RNA-seq分析表明,L330P/Q331R突变导致TP53的表达明显降低并促进了 GPX4-In-3诱导的HeLa细胞死亡。