本文利用中药三七的有效成分三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)改善血液微循环,抑制血小板聚集的药理作用及烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)减少血管中胶原蛋白沉积,降低血管阻塞的功效特点,将二者复配使用时发现其具有协同作用。因此,本课题将三七总皂苷与烟酰胺单核苷酸制备成PNS与NMN的复合制剂——脂质体(Liposomes,Lip)水凝胶贴剂,即一种剂量准确、毒副作用小的治疗眼部血瘀的外用制剂(以下简称NMN-PNS复方水凝胶贴剂)。研究内容分为以下几部分:第一部分:NMN-PNS复方水凝胶贴剂的制备工艺研究(1)三七总皂苷与烟酰胺单核苷酸协同效应的考察:利用体外抗凝血实验,以凝血时间的延长作为评价指标,探究三七总皂peptidoglycan biosynthesis苷与烟酰胺单核苷酸联合用药药效。将复方药物与单剂量样品组相比较,经原料药预实验结果可得,在减少三七总皂苷用药量的同时,复方药物延长凝血时间约为三七皂苷单剂量组的1.5倍,烟酰胺单核苷酸组的1.77倍。由此发现,三七总皂苷与烟酰胺单核苷酸联合用药时具有抗凝协同作用。(2)三七总皂苷脂质体的工艺研究:采用薄膜水化法,以大豆卵磷脂,胆固醇作为脂质材料制备三七总皂苷脂质体。确定脂质体包封率与载药量为评价指标。通过单因素及响应面优化实验筛选出三七总皂苷脂质体的最佳制备工艺处方为:药脂比1:4、磷脂比1:8、水化温度25℃、水化时间60 min。经验证性实验可知,所得三七总皂苷脂质体平均包封率为80.95%,RSD为1.07%,平均载药量为15.21%,RSD为1.91%,外观为单层脂质囊泡,类球形,粒径为(183.8±9.32)nm。以粒径、性状作为冻干工艺评价指标,对所制备的三七总皂苷脂质体进行冷冻干燥,通过单因素及正交实验确定其制备工艺处方为:甘露醇作为冻干保护剂,浓度为2.5%,预冻温度-80℃,预冻时间18 h。复溶后脂质体冻干制剂的粒径为(228.7±6.43)nm。对所制备的脂质体冻干制剂进行FTIR、DSC表征,其结果显示药物与脂质材料之间仅存在氢键与范德华力作用,药物结构未发生变化。(3)NMN-PNS复方水凝胶贴剂的制备及基质处方筛选:将聚丙烯酸钠与丙三醇以1:4的质量比制成Ⅰ相;0.3%卡波姆溶液,加入处方量三七总皂苷脂质体及烟酰胺单核苷酸混匀为Ⅱ相;等量递加法将Ⅰ相与Ⅱ相混匀后加入Ⅲ相交联剂(5%的氯化铝与EDTA-2Na溶液)中,形成复方水凝胶剂。将上述所制备的含药水凝胶均匀涂布于无纺布,压辊滚压铺平,静置24 h后即得NMN-PNS复方水凝胶贴剂。以凝胶初黏度、残留量等质量因素作为质量评分标准,利用单因素及响应面优化实验,确定了复方水凝胶贴剂的最佳制备工艺处方为:0.3%卡波姆溶液43.75%,聚丙烯酸钠4.69%,丙三醇18.75%,氯化铝1.56%。复方水凝胶贴剂含膏量为20.72±0.63 g/100 cm~2,三七总皂苷含量0.53±0.16 mg/m L,烟酰胺单核苷酸含量1.61±0.38 mg/m L。(4)NMN-PNS复方水凝胶贴剂的体外药物释放及经皮渗透性能研究:通过体外透析法进行PNS-NMN原药复方凝胶贴剂与PNS_(Lip)-NMN复方水凝胶贴剂的体外释药性考察。实验结果表明,未形成脂质体的三七总皂苷复方凝胶中三七总皂苷的释放符合一级释放规律,方程为:Q_t=72.642(1-e~(-0.077t)),而形成脂质体的三七总皂苷复方凝胶剂中三七总皂苷的释放则符合Higuchi模型,方程为:Q_t=10.055t~(1/2)+0.521,烟酰胺单核苷酸则因其水溶性呈现一级释放规律,PNS-NMN原药复方凝胶贴剂中NMN方程为Q_t=59.824(1-e~(-0.096t)),PNS_(Lip)-NMN复方水凝胶贴剂中NMN方程为Q_t=63.605(1-e~(-0.086t))。采用Franz扩散池,分别对PNS-NMN原药复方凝胶贴剂与PNS_(Lip)-NMN复方水凝胶贴剂进行经皮渗透性考察。实验结果表明,3%氮酮为该制剂的最佳促渗剂,PNS_(Lip)-NMN复方水凝胶贴剂的经皮渗透效果为PNS-NMN原药复方水凝胶贴剂的5倍。第二部分:NMN-PNS复方水凝胶贴剂质量标准建立及稳定性考察(1)NMN-PNS复方水凝胶贴剂含量测定方法的建立:确定复方水凝胶贴剂的含量测定方法为紫Belumosudil研究购买外-二阶导数光谱法。具体实验方法为:用80%无水乙醇配制不同浓度的三七总皂苷、烟酰胺单核苷酸单组份及混合标准溶液,使得三七总皂苷浓度为0.01～0.1 mg/m L,烟酰胺浓度为0.01～0.1 mg/m L,扫描其在245-300 nm范围内的吸光度,并采用Origin软件对其吸收光谱进行二阶求导,确定其测定波长为278 nm(PNS)、265 nm(NMN),所得到的线性回归方程分别为C=-14017D-5.4056,R~2=0.9988(PNS),NSC 125973C=-24254D-3.3501,R~2=0.9892(NMN)。应用上述方法对加样样品进行有效成分含量测定,实验结果表明PNS测定结果的RSD为0.23%,加样回收率为99.05%,NMN测定结果的RSD为0.18%,加样回收率为99.86%,该方法摒弃了传统紫外分析须经分离进行含量测定的复杂方法,精密度、重现性良好,可直接同时测定两种药物的含量。(2)NMN-PNS复方水凝胶贴剂质量标准建立:参考2020版《中国药典》对复方水凝胶贴剂在外观性状、含膏量、赋形性、粘附力等方面建立了完整的质量评价体系。所制备的复方水凝胶贴剂外观为涂布均匀的淡黄色凝胶,滚球斜坡停止法测定其初黏力在24.6-25.6号钢球范围。每贴含膏量为20.72±0.63 g/100 cm~2。(3)复方水凝胶贴剂稳定性实验研究:分别对复方水凝胶贴剂进行高温、高湿、4500lx强光照射实验。发现高湿及强光照射实验不影响贴剂的质量,而高温60℃时,药物含量下降,在4℃、25℃、45℃条件下贴剂的性质均稳定不变。确定该复方水凝胶制剂的贮存条件为密封、室温条件下贮存。第三部分:NMN-PNS复方水凝胶贴剂的安全性及体外药效学研究(1)皮肤刺激性实验:采用新西兰大白兔进行活体皮肤刺激性实验以评估制剂安全性能。其实验结果表明,复方水凝胶贴剂的完整及破损皮肤组均未出现红肿、斑块等皮肤刺激性现象。(2)复方水凝胶贴剂的体外药效研究表明:以凝血时间及溶栓效率为研究对象,利用体外抗凝血实验及体外溶栓实验比较PNS与NMN单独用药和联合用药的溶栓效率及对凝血时间的延长作用,确定联合给药用药剂量。其实验结果表明,同一给药剂量下,以延长ATPP凝血时间为评价指标,联合用药延长凝血时间为PNS脂质体单剂量组的1.2倍,NMN单剂量组的1.7倍,最佳复方药物浓度比为3:1(PNS:NMN)。联合用药时最佳给药剂量仅为单方给药量的50%,即三七总皂苷浓度为10.88 mg/m L,烟酰胺单核苷酸浓度为3.63 mg/m L。PNS与NMN联合用药具有协同作用的趋势,且与单独用药相比具有用药量少,药效增强的显著优势。通过对复方药物进行体外溶栓实验,所制备的复方药物溶栓效率比三七总皂苷单剂量用药提高1.6倍,对比单剂量烟酰胺单核苷酸效果不明显。NMN-PNS复方水凝胶贴剂的体外药效研究中均发现PNS与NMN浓度比为3:1的溶栓抗凝效果最佳。综上所述,本课题所研制的NMN-PNS复方水凝胶贴剂,具有抗凝协同作用,且用药剂量减少,体外药物释放具有规律性,为三七总皂苷中药现代化与烟酰胺单核苷酸在外用制剂的应用提供了可靠详实的理论依据。