研究背景:血小板激活是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的始动因素和核心环节。因此,双联抗血小板治疗(dual antiplatelet therapy,DAPT)是AMI治疗的基石。有研究表明,目前的抗血小板药物可能无法抑制其它血小板活化途径,导致缺血性心脑血管事件复发风险显著升高。同时,冠心病是一种慢性炎症性疾病,炎症作用贯穿于动脉粥样硬化发展的全过程。血小板不仅是血栓形成的效应细胞,还具有调节免疫、炎症反应的作用。因此,血小板可能通过炎症信号通路诱导血小板活化,发生“血小板逃逸”,从而产生高血小板反应性(high platelet reactivity,HPR)。然而,炎症诱导血小板活化的具体机制目前尚不明确。因此,本研究将从临床病例、动物模型及体外血小板培养多层次探讨炎症诱导血小板活化的作用和机制,为探索抗血小板治疗后HPR的发生机制和寻找新的治疗靶点提供理论基础。第一部分抗血小板治疗后高血小板反应性对血小板功能的影响目的:观察抗血小板治疗后高血小板反应性(HPR)对血小板活化和聚集的影响。方法:1、随机纳入2022年7月1日至8月31日在南昌大学第二附属医院心血管内科住院的首发急性心肌梗死(AMI)患者20例、HPR患者20例。随机选择20例经冠脉动脉造影排外冠心病诊断的患者作为对照。2、收集患者的一般临床基线资料,包括年龄、性别、收缩压、舒张压、既往病史、吸烟史、血常规、血脂、血糖、肾功能及用药情况。3、血小板功能分析仪检测各组患者的血小板最大聚集率(MAR)和平均聚集率(AAR)。4、提取患者血小板RNA和蛋白,qRT-PCR检测血小板miR-96表达CB-839核磁水平,Western Blot(WB)检测血小板VAMP8、CD62P及PAC-1蛋白表达水平。结果:1、与对照组相比,HPR组和AMI组患者年龄更大、既往高血压和糖尿病病史比例更高(P<0.05);白细胞计数、中性粒细胞绝对值、血清葡萄糖及糖化血红蛋白显著升高,而高密度脂蛋白胆固醇显著降低(P<0.05);HPR组使用氯吡格雷比例更高,而AMI组使用替格瑞洛比例更高(P<0.05)。2、血小板功能分析仪结果显示,与对照组相比,HPR组和AMI组患者的血小板MAR和AAR均显著升高(P<0.05)。3、qRT-PCR结果显示,与对照组患者相比,HPR组和AMI组患者血小板miR-96表达水平均显著降低,AMI组降低更显著(P<0.05)。4、WB结果显示,与对照组患者相比,HPR组和AMI组患者血小板VAMP8、CD62P及PAC-1蛋白表达水平均显著升高,AMI组患者升高更显著(P<0.05)。结论:1、抗血小板治疗后HPR患者血小板活化和聚集增强。2、抗血小板治疗后HPR患者血小板miR-96表达降低而VAMP8蛋白表达升高。第二部分脂多糖诱导的炎症对血小板功能的影响目的:观察脂多糖(LPS)诱导的炎症对血小板活化和聚集的影响。方法:1、本研究以250 g左右雄性SD大鼠和6-8周龄C57B6J小鼠为研究对象。2、适应性喂养1周后分为对照组(连续灌胃生理盐水5天+第6天腹腔注射生理盐水)、LPS组(连续灌胃生理盐水5天+第6天腹腔注射LPS)、DAPT组(连续灌胃双抗药物5天+第6天腹腔注射生理盐水)及DAPT+LPS组(连续灌胃双抗药物5天+第6天腹腔注射LPS),大鼠每组6只,小鼠每组10只。3、双抗药物灌胃剂量为阿司匹林10 mg/Kg/day和替格瑞洛9 mg/Kg/day,生理盐水灌胃剂量为等体积的0.9%氯化钠溶液,连续灌胃5天,第6天腹腔注射LPS 10 mg/Kg诱导急性炎症,生理盐水注射剂量为等体积的0.9%氯化钠溶液。LPS处理1小时后心脏采血并分离血小板。4、qRT-PCR检测血小板miR96表达水平,WB检测血小板VAMP8和血小板活化分子蛋白表达水平。血小板功能分析仪检测血小板聚集率。氯化铁诱导颈动脉损伤评估血栓致血管闭塞时间,断尾试验评估小鼠出血时间。透射电镜观察血小板线粒体的形态结构,荧光显微镜评估线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平。结果:1、灌胃阿司匹林和替格瑞洛组大鼠和小鼠活跃度较前降低。腹腔注射LPS后大鼠和小鼠出现不同程度的腹泻,排不成形黄色稀便,精神状况较注射前变差,而腹腔注射生理盐水未出现腹泻,精神状态无变化。2、qRT-PCR结果显示,与对照组和DAPT组相比,LPS组和DAPT+LPS组大鼠血小板miR96表达水平显著降低,其中LPS组大鼠血小板miR96表达水平较DAPT+LPS组更低(P<0.05)。3、WB结果显示,LPS组和DAPT+LPS组大鼠血小板VAMP8、CD62P及PAC1蛋白表达水平较对照组和DAPT组显著升高(P<0.05),而对照组和DAPT组与LPS组更多和DAPT+LPS组大鼠血小板VAMP8、CD62P及PAC1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。4、血小板功能分析仪结果显示,与对照组和DAPT组相比,LPS和DAPT+LPS组大鼠血小板MAR均显著升高,其中LPS组血小板MAR最高(P<0.05)。与对照组相比,LPS组大鼠血小板AAR显著升高(P<0.05),DAPT+LPS组大鼠血小板AAR显著高于DAPT组(P<0.05),但是与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。5、与对照组相比,LPS组小鼠颈动脉损伤后血栓致血管闭塞时间和断尾出血时间显著缩短,而DAPT组均显著延长(P<0.05)。DAPT+LPS组小鼠颈动脉损伤后血栓致血管闭塞时间和断尾出血时间均较LPS组延长、较DAPT组缩短(P<0.05)。6、透射电镜结果显示,对照组和DAPT组大鼠血小板线粒体成椭圆形短棒状,双层膜结构完整,未出现破裂、融合,线粒体内层嵴结构正常。LPS组大鼠血小板线粒体外膜破裂,内层嵴融合消失。DAPT+LPS组大鼠血小板线粒体明显肿大,线粒体内层嵴结构融合扩大。7、荧光显微镜结果显示,与对照组相比,LPS组和DAPT+LPS组大鼠血小板线粒体膜电位显著降低、ROS水平显著升高(P<0.05)。其中DAPT+LPS组大鼠血小板线粒体膜电位较LPS组增高,较DAPT组降低;ROS水平较LPS组降低,较DAPT组增高(P<0.05)。结论:1、LPS诱导的炎症可以使血小板活化和聚集功能增强,从而促进血栓形成,其中miR-96和VAMP8可能参与LPS诱导的血小板活化过程。2、LPS诱导的炎症可以使血小板线粒体结构和功能发生损伤。第三部分miR-96/VAMP8调控脂多糖诱导血小板活化的作用和机制目的:探讨miR-96/VAMP8通路在脂多糖(LPS)诱导血小板活化中的作用和机制。方法:1、以人成巨核细胞白血病细胞(Meg-01细胞)为研究对象。分组为对照组、LPS组、DAPT组及DAPT+LPS组。对照组不加任何药物干预,DAPT组和DAPT+LPS组加入终浓度为2 mmol/L的阿司匹林和终浓度为10μmol/L的替格瑞洛干预1小时。1小时后在LPS组和DAPT+LPS组中加入终浓度为5μg/m L的LPS干预4小时。2、qRT-PCR检测细胞miR-96表达水平,WB检测细胞VAMP8和血小板活化分子蛋白表达水平。免疫荧光观察细胞内VAMP8表达水平。透射电镜观察细胞线粒体形态结构。荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位和ROS变化。3、通过转染miR-96模拟物和抑制物调控miR-96水平,WB检测细胞VAMP8和血小板活化分子蛋白表达。免疫荧光观察细胞内VAMP8表达水平。透射电镜观察细胞线粒体形态结构。荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位和ROS变化。4、通过转染VAMP8干扰片段降低VAMP8表达,WB检测细胞血小板活化分子蛋白表达。免疫荧光观察细胞内VAMP8表达水平。透射电镜观察细胞线粒体形态结构。荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位和细胞ROS变化。结果:1、qRT-PCR结果显示,与对照组和DAPT组相比,LPS组和DAPT+LPS组细胞miR-96表达水平均显著降低(P<0.05)。WB结果显示,与对照组和DAPT组相比,LPS组和DAPT+LPS组细胞VAMP8、CD62P及PAC-1蛋白表达水平显著升高,其中LPS组VAMP8蛋白表达水平较DAPT+LPS组升高更显著(P<0.05)。免疫荧光结果显示,LPS组和DAPT+LPS组细胞VAMP8荧光强度显著强于对照组和DAPT组,并且LPS组细胞VAMP8荧光强度强于DAPT+LPS组(P<0.05)。透射电镜结果显示,对照组和DAPT组细胞线粒体形态正常,双层膜结构存在,内层嵴结构正常,而LPS组细胞线粒体双层膜破裂,内层嵴融合消失,DAPT+LPS组线粒体双层膜破裂,内层嵴结构明显增宽,甚至消失。荧光显微镜和流式细胞术结果显示LPS组和DAPT+LPS组线粒体膜电位显著降低、ROS生成水平显著增加(P<0.05)。2、向细胞转染miR-96 mimic和inhibitor后,qRT-PCR结果显示miR-96 mimic组细胞miR-96表达显著升高,而miR-96 inhibitor组细胞miR-96表达显著降低(P<0.05)。WB结果显示,与对照组相比,DAPT+LPS组、DAPT+LPS+miR-96mimic组及DAPT+LPS+miR-96 inhibitor组细胞VAMP8、CD62P及PAC-1均显著升高(P<0.05)。与DAPT+LPS组相比,DAPT+LPS+miR-96 mimic组细胞VAMP8、CD62P及PAC-1均显著降低,而DAPT+LPS+miR-96 inhibitor组细胞VAMP8、CD62P及PAC-1均进一步升高(P<0.05)。免疫荧光结果显示,各组细胞VAMP8荧光强度趋势与VAMP8蛋白表达水平变化趋势相同。透射电镜结果显示,DAPT+LPS组、DAPT+LPS+miR-96 mimic组及DAPT+LPS+miR-96inhibitor组细胞线粒体均出现不同程度的膜结构破损,内层嵴结构增宽或融合,其中以DAPT+LPS+miR-96 inhibitor组细胞线粒体损伤最重。流式细胞术结果显示DAPT+LPS组、DAPT+LPS+miR-96 mimic组及DAPT+LPS+miR-96 inhibitor组细胞线粒体膜电位均显著降低、ROS生成水平均显著增加,以DAPT+LPS+miR-96 inhibitor组变化最明显(P<0.05)。3、向细胞转染Si-VAMP8后,免疫荧光结果显示,与对照组相比,DAPT+LPS组和DAPT+LPS+Si-VAMP8组细胞内VAMP8荧光强度显著增加,而DAPT+LPS+Si-VAMP8组较DAPT+LPS组降低(P<0.05)。WB结果显示,与对照组相比,DAPT+LPS组和DAPT+LPS+Si-VAMP8组细胞CD62P和PAC-1蛋白表达均显著升高,而DAPT+LPS+Si-VAMP8组细胞CD62P和PAC-1蛋白表达较DAPT+LPS组显著降低(P<0.05)。透射电镜结果显示,DAPT+LPS组和DAPT+LPS+Si-VAMP8组细胞线粒体均出现不同程度的膜结构破损,内层嵴结构增宽或融合,以DAPT+LPS组损伤最明显。流式细胞术结果显示,与对照组相比,DAPT+LPS组和DAPT+LPS+Si-VAMP8组细胞线粒体膜电位均降低,而DAPT+LPS+Si-VAMP8组较DAPT+LPS组稍升高(P<0seed infection.05);DAPT+LPS组和DAPT+LPS+Si-VAMP8组细胞ROS生成水平均显著升高,而DAPT+LPS+Si-VAMP8组较DAPT+LPS组稍降低(P<0.05)。结论:LPS诱导的炎症可引起血小板线粒体损伤,促进血小板活化,miR-96/VAMP8可能是LPS诱导血小板活化的重要通路。