原发性肝癌是临床常见的一种恶性肿瘤,依据组织病理学可将其划分成肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)以及HCC-ICC混合型三种类型。原发性肝癌最为突出的流行病学特点是HCC的占比可高达90%～95%。根据我国2022版《原发性肝癌诊疗指南》数据,HCC发病率高居第4位,特别是HCC病死率高居第2位。世界范围内,HCC也是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,HCC的发病率和死亡率均呈逐年上升趋势。肝脏切除或肝脏移植手术在HCC治疗方案中十分重要,但是能够获得根治性肝脏手术的患者仅20%～40%。很多患者由于多种原因,失去初治时接受根治性手术的机会。在分子靶向治疗药物中,索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼是临床最常用的多受体酪氨酸激酶抑制剂(multi-receptor tyrosine kinase(multi-RTK)inhibitors),它们作为分子靶向药物在晚期HCC患者的治疗过程中,发挥非常重要的作用。multi-RTK抑制剂对肝癌细胞具有直接的抗增殖和促凋亡作用,同时抑制肿瘤组织血管生成,对细胞免疫反应也具有一定的调控效应。但三种药物在临床指南中的地位略有不同,索拉非尼、仑伐替尼均是临床治疗晚期HCC的一线用药。既往研究显示对比索拉非尼,仑伐替尼可延长肝癌患者的无进展生存(progression-free survival,PFS)和客观缓解率(objective response rate,ORR),且更适合亚洲人。而瑞戈非尼是治疗肝癌的二线用药,常用于索拉非尼一线治疗失败后的序贯治疗,使晚期肝癌患者生存获益显著。上述差异均提示三种药物的作用机制可能存在不同,特别是导致三种药物疗效差别的确切机制仍不清楚,针对这一科研热点,我们进行了探索和研究。本研究中,我们首先对一线分子靶向药物索拉非尼与仑伐替尼治疗晚期HCC临床疗效进行了荟萃分析。为探索临床常用一线、二线多激酶抑制剂疗效差异背后的确切机制,我们对索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼在人肝癌Huh-7细胞增殖、细胞周期分布以及细胞凋亡的作用特点进行了比较。为了进一步分析索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼对Huh-7细胞周期和凋亡作用差异的潜在机制,我们使用基于串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)的定量蛋白质组学技术,分析并比较了半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration,IC_(Biofilter salt acclimatization50))下索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼对Huh-7细胞蛋白质组学的不同作用。并聚焦于三个药物组细胞的共享差异蛋白进行信号通路分析,以期了解索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼抑制人肝癌Huh-7细胞增殖时,哪些与细胞周期、DNA合成以及细胞凋亡相关的信号通路蛋白发生了变化,特别是这些信号通路蛋白的变化程度在索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼三组间有无显著差别,以期为临床常用的多激酶抑制剂个体化的选择应用提供重要参考价值。第一部分索拉非尼与仑伐替尼治疗晚期肝细胞癌的临床疗效分析目的:对比分析仑伐替尼与索拉非尼作为一线分子靶向药物治疗晚期肝细胞癌的临床疗效。方法:通过检索Cochrane、Web of Science、Pub Med、中国知网、万方等数据库中有关索拉非尼和仑伐替尼作为一线用药治疗晚期肝细胞癌临床疗效对比的相关文献,检索日期2019年1月1日至2021年12月31日。根据所设定的纳入和排除文献标准,进行文献筛选、数据整理和文献评价。所分析的指标包括晚期肝细胞癌患者的客观缓解率(objective response rate,ORR)、无进展生存期(progression-free survival,PFS)、总生存期(overall survival,OS)。纳入文献采用Stata 11.0(Stata Corporation,College Station,TX)软件进行荟萃分析。结果:1.文献基本特征及质量评价根据检索策略及手工检索初步获得355篇文献,经筛选后最终纳入6篇,共1465例患者,其中仑伐替尼组582例,索拉非尼组883例。总体而言,在纳入的文献中,男性所占比率较高,感染病毒是主要的肝病基础,患者肝功能分级以Child Pugh A级占比高,肝癌分期为以巴塞罗那分期C期为主。2.临床荟萃分析的观察指标共有4篇文献报道了ORR,2篇文献报道了PFS,3篇文献报道了OS数据,采用固定效应模型分析,结果显示与索拉非尼组相比,仑伐替尼组在ORR(OR=11.16,95%CI:6.08～20.48,P<0.001)、PFS(OR=0.49,95%CI:0.34～0.71,P<0.001)方面更优。采用随机效应模型分析,两组OS(OR=0.70,95%CI:0.39～1.24,P=0.220)无统计学差异。小结:在晚期肝细胞癌患者的治疗中,与索拉非尼比较,仑伐替尼可提高患者的ORR并延长患者的PFS,但无论选择索拉非尼还是仑伐替尼,两组患者的OS并没有显著差异。第二部分三种多激酶抑制剂影响肝癌细胞周期及凋亡的对比研究目的:对比分析索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼对人肝癌Huh-7细胞增殖、细胞周期分布以及细胞凋亡的作用特点。方法:细胞增殖实验:将对数增长期Huh-7细胞,以每孔约5×10~3个细胞的密度接种在96孔板中,实验分为空白对照(生理盐水)培养基组、溶剂对照(二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide,DMSO)培养基组以及含索拉非尼、仑伐替尼和或戈非尼培养基组(多个药物浓度)。每次实验仅选择一个multi-RTK抑制剂进行实验。每个药物浓度组均设置6个重复孔,培养24 h、48 h或72 h后,测定各个药物抑制细胞增殖的IC_(50)值。细胞周期实验:实验分为5个组,包括空白对照(生理盐水)组、溶剂对照(DMSO)组、索拉非尼IC_(50)组、仑伐替尼IC_(50)组和瑞戈非尼IC_(50)组,每个组均设置3个重复孔。细胞在培养箱中孵育72 h后,细胞样本由Coulter EPICS XL流式细胞仪检测,数据采集和定量分析使用EXPO32-ADC软件,以获取G_0/G_1期、S期和G_2/M期细胞分布相关的信息。细胞凋亡实验:细胞培养、实验分组以及药物与细胞孵育过程同细胞周期实验。细胞在培养箱中孵育72 h后,通过Coulter EPICS XL MCL流式细胞仪检测,数据采集和定量分析使用EXPO32-ADC软件。在488 nm波长的激发光照射下,测定早期凋亡(early apoptosis)、晚期凋亡(late apoptosis)、坏死细胞(necrotic cells)和正常细胞。结果:1.对比三种multi-RTK抑制剂对Huh-7细胞生长曲线的影响索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别以浓度和时间依赖的方式抑制Huh-7细胞的增殖。multi-RTK抑制剂与Huh-7细胞孵育72 h后,索拉非尼的IC_(50)值为3.738(3.504-3.987)μM,瑞戈非尼为1.322(1.215-1.437)μM,仑伐替尼为0.814(0.648-1.023)μM。仑伐替尼的IC_(50)值显著小于瑞戈非尼(P<0.01),瑞戈非尼的IC_(50)值显著小于索拉非尼(P<0.01)。Huh-7细胞与三种抑制剂孵育72 h后,索拉非尼(21μM)、瑞戈非尼(21μM)和仑伐替尼(35μM)对Huh-7细胞增殖的最大抑制率,分别达到99.8±0.2%、98.7±0.1%和83.4±0.5%。2.对比三种multi-RTK抑制剂对Huh-7细胞周期的影响与DMSO组的G_0/G_1期(49.6%)和S期(36.3%)相比,索拉非尼组G_0/G_1期细胞百分比显著升高(65.4%,P<0.01),而S期细胞百分比显著降低(23.3%,P<0.01)。仑伐替尼组和瑞戈非尼组对G_0/G_1期细胞和S期细胞的作用与索拉非尼相似,但其作用分别显著强于索拉非尼组(P<0.05和P<0.01)。与DMSO组相比,仑伐替尼或瑞戈非尼显著降低了G_2/M期细胞的百分比(P<0.01),但索拉非尼的降低作用未见统计学差异(P>0.05);此外,瑞戈非尼对G_2/M期细胞百分比的减少作用明显强于索拉非尼(P<0.05)。3.对比三种multi-RTK抑制剂对Huh-7细胞凋亡的影响细胞凋亡的统计结果显示,与对照组相比,DMSO组的细胞分布未发生显著变化(P>0.05)。IC_(50)浓度的索拉非尼仅显著增加早期凋亡细胞的比例,从DMSO组的6.7%增加到11.1%(P<0.01)。此外,与DMSO组相比,仑伐替尼组的早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞分别显著增加1.3倍、121倍和64倍(P<0.01);尤其是,与仑伐替尼组相比,IC_(50)浓度的瑞戈非尼组的晚期凋亡细胞和坏死细胞分别显著增加了0.4倍和1.4倍(P<0.05和P<0.01)。小结:本研究建立了索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼抑制人肝癌Huh-7细胞增殖的浓度-效应曲线,三者的IC_(50)值分别是3.738μM、1.322μM和0.814μM。在IC_(50)浓度下,仑伐替尼和瑞戈非尼可能对人肝癌Huh-7细胞DNA合成具有更强的抑制作用,导致更多的Huh-7细胞阻滞于G_0/G_1期,同时减少了S期和G_2/M期细胞。与索拉非尼和瑞戈非尼相比,仑伐替尼诱导Huh-7细胞早期凋亡的能力更强,而瑞戈非尼诱导的坏死细胞比例是仑伐替尼的2.4倍。第三部分三种多激酶抑制剂对肝癌细胞蛋白质组影响的对比研究目的:使用基于串联质谱标签(TMT)的定量蛋白质组学技术,分析IC_(50)浓度下索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼对人肝癌Huh-7细胞蛋白质组学的不同作用。方法:将对数增长期Huh-7细胞接种在75-cm~2培养瓶中,每个培养瓶中接种1.2×10~6个细胞,并分为5个实验组,包括空白对照(生理盐水)组、溶剂对照(DMSO)组、索拉非尼IC_(50)组、仑伐替尼IC_(50)组和瑞戈非尼IC_(50)组,实验重复3次(n=3)。细胞在培养箱中孵育72 h后,消化、离心(4℃)和收集Huh-7细胞,并获得Huh-7细胞总蛋白提取液样品。通过细胞总蛋白提取液样品的蛋白浓度测定、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析、细胞总蛋白提取液样品中蛋白的还原和烷基化反应、蛋白样品的酶解及脱盐、肽段样品的同位素标记、TMT-标记肽段样本混合为3批次样本、TMT-标记混合肽段样品的脱盐以及脱盐以及混合肽段样品经RP-HPLC系统的组分收集,最终得到3批共计33个待测样品(每个批次含有11个待测样品)。采用纳升型超高效液相色谱仪串联Orbitrap Fusion高分辨质谱仪(Easy-n LC 1000 HPLC/Orbitrap Fusion Mass Spectrometer/Nano Flex source),对样品中TMT标记的肽段进行分离。采用Proteome Discoverer2.1软件(Thermo Scientific,美国)、搜索引擎SEQUEST HT、人类蛋白质组数据库(www.uniprot.org,更新于2021.7),对原始谱图文件进行搜库分析。在“悟空”平台上完成主成分分析(principal component analysis,PCA)、系统聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA)、韦恩图(Venn diagram)分析和火山图(volcano plot)分析。结果:1.蛋白质组学方法的质量控制和蛋白质定量检测五个实验组的15份样本中,各组内的3个样品的蛋白浓度变化小,均在理论蛋白浓度范围之内,表明各样品的蛋白提取合格。所提取蛋白的SDS-PAGE凝胶扫描条带整齐且未见杂质,提取蛋白的质量较高。共进行了3个批次的蛋白检测,第一批次共检出18546个蛋白,第二批次共检出17301个蛋白,第三批次共检出15901个蛋白;共计检出11577个蛋白。我们对此11577个蛋白进行了分析。2.总鉴定蛋白的主成分分析主成分分析(PCA)结果表明,索拉非尼、仑伐替尼和瑞Trichostatin A采购戈非尼三组共9个样本中所鉴定的蛋白质,在组间存在明显差异。在PC1方向,索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼三组的9个样本与对照组和DMSO组的6个样本显著分离;同时索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼各组的3个样本,在各自的组内呈重叠分布,在组间则明显分离;此外,0.1‰DMSO组的3个样本与对照组的3个样本几乎呈完全重叠分布状态。在PC2方向,索拉非尼和瑞戈非尼二组的6个样本与仑伐替尼组的3个样本显著分离;0.1‰DMSO组的3个样本与对照组的3个样本依然呈完全重叠分布状态。3.总鉴定蛋白的层聚类分析无监督层聚类分析(HCA)热图的行聚类树状图中,簇1(cluster 1)和簇2(cluster 2)中分别包含6521个蛋白质和5056个蛋白质。总体来讲,图中索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼组9个样本的簇1群蛋白质(6521个),与对照组和DMSO组相比,明显下调。相反,图中索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼组9个样本的簇2群蛋白质(5056个),与对照组和DMSO组相比,明显上调。在列聚类树状图中,索拉非尼、仑伐替尼以及瑞戈非尼组的样本在各自的组内聚集在一起,并且所有样本的排列均与DMSO组和对照组明显分开。与前述PCA分析结果相同,HCA热图中DMSO组的3个样本与对照组的3个样本,依然呈重叠分布状态。4.索拉非尼与DMSO组间的差异蛋白火山图分析火山图分析结果显示,与DMSO组相比,IC_(50)浓度的索拉非尼与Huh-7细胞孵育72 h后,共鉴定出差异蛋白1165个(P<0.05),其中上调蛋白565个,下调蛋白质600个。5.仑伐替尼与DMSO组间的差异蛋白火山图分析火山图分析结果显示,与DMSO组相比,IC_(50)浓度的仑伐替尼与Huh-7细胞孵育72 h后,共鉴定出差异蛋白2739个(P<0.05),其中上调蛋白982个,下调蛋白质1757个。6.瑞戈非尼与DMSO组间的差异蛋白火山图分析火山图分析结果显示,与DMSO组相比,IC_(50)浓度的瑞戈非尼与Huh-7细胞孵育72 h后,共鉴定出差异蛋白2010个(P<0.05),其中上调蛋白855个,下调蛋白质1155个。小结:IC_(50)浓度的索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼作用于人肝癌Huh-7细胞72 h后,利用串联质谱标签(TMT)的定量蛋白质组学技术,共鉴定到11577个蛋白;经三者干预的细胞中,分别发现了1165个、2739个和2010个差异蛋白。在干扰细胞蛋白质表达方面,仑伐替尼的作用最强,索拉非尼的作用最弱;此外,瑞戈非尼和仑伐替尼下调蛋白的作用更强,下调蛋白的数量分别是上调蛋白的1.4倍和1.8倍。第四部分三种多激酶抑制剂抗肝癌细胞增殖差异的机制分析及其在HCC治疗的临床意义目的:分析索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼抑制人肝癌Huh-7细胞增殖时,与细胞周期、DNA合成以及细胞凋亡相关的信号通路蛋白发生了哪些变化,特别是这些信号通路蛋白的变化程度在索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼三组间有无显著差别。方法:将索拉非尼组1165个差异蛋白中的565个上调蛋白、仑伐替尼组2739个差异蛋白中的982个上调蛋白以及瑞戈非尼组2010个差异蛋白中的855个上调蛋白,通过维恩图进行并集后,分别计算索拉非尼与仑伐替尼两组间、索拉非尼与瑞戈非尼两组间、仑伐替尼与瑞戈非尼两组间以及索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼三组间,共享的上调差异蛋白数量。将索拉非尼组1165个差异蛋白中的600个下调蛋白、仑伐替尼组2739个差异蛋白中的1757个下调蛋白以及瑞戈非尼组2010个差异蛋白中的1155个下调蛋白,通过维恩图进行并集后,分别计算索拉非尼与仑伐替尼两组间、索拉非尼与瑞戈非尼两组间、仑伐替尼与瑞戈非尼两组间以及索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼三组间,共享的下调差异蛋白数量。通过计算机,搜索DAVID Bioinformatics Resources(NIAID/NIH)在线平台(https://david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp),进入Functional Annotation Tool的Upload页面,在Step 1方框内输入全部的共同上调差异蛋白或共同下调差异蛋白;进入Annotation Summary Chart页面,显示这些差异蛋白所涉及的信号通路及蛋白的变化程度在索拉非尼、瑞戈非尼和仑伐替尼三组间的统计学差异。最后,为了探讨本研究结果与临床HCC患者诊断以及三个multi-RTK抑制剂单独或与其他治疗联合应用时治疗效果的临床应用价值,将影响信号通路变化的差异蛋白逐一进行国内外临床研究文献的对比分析。以明确哪些差异蛋白可为临床原发性肝癌患者的诊断治疗及预测预后,特别是为临床常用的多激酶抑制剂的应用选择提供重要参考价值。结果:1.三种multi-RTK抑制剂共享的上调差异蛋白IC_(50)浓度的索拉非尼与仑伐替尼使Huh-7细胞出现了1222个上调差异蛋白,二者共享的上调差异蛋白325个;IC_(50)浓度的索拉非尼与瑞戈非尼使Huh-7细胞出现了741个上调差异蛋白,二者共享的上调差异蛋白389个;IC_(50)浓度的仑伐替尼与瑞戈非尼使Huh-7细胞出现了1333个上调差异蛋白,二者共享的上调差异蛋白504个。此外,三个药物各自均上调了相同的259个蛋白。2.三种multi-RTK抑制剂共享的下调差异蛋白IC_(50)浓度的索拉非尼与仑伐替尼使Huh-7细胞出现了1858个下调差异蛋白,二者共享的下调差异蛋白499个;IC_(50)浓度的索拉非尼与瑞戈非尼使Huh-7细胞出现了1278个下调差异蛋白,二者共享的下调差异蛋白477个;IC_(50)浓度的仑伐替尼与瑞戈非尼使Huh-7细胞出现了2047个下调差异蛋白,二者共享的下调差异蛋白865个。此外,三个药物各自均下调了相同的419个蛋白。3.共享下调差异蛋白的KEGG分析IC_(50)浓度的索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别与Huh-7细胞孵育72 h后,三个药物各自均下调了相同的419个蛋白(P<0.05)。419个蛋白质涉及10个KEGG通路显著富集(P<0.05),其中排名前六位的通路是:剪接体相关信号通路、DNA复制相关信号通路、细胞周期信号通路、m RNA监控信号通路、P53信号通路和核苷酸切除修复信号通路。3.1细胞周期信号通路索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别显著下调了PCNA的表达(P<0.05),仑伐替尼和瑞戈非尼下调PCNA表达的作用显著强于索拉非尼(P<0.05和P<0.01)。索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别显著下调了MCM3、MCM4、SKP1和Bub3的表达(P<0.05和P<0.01),瑞戈非尼下调MCM3表达的作用显著强于索拉非尼(P<0.01);与DMSO相比,瑞戈非尼使MCM3和MCM4的表达至少下调了28%。仑伐替尼和瑞戈非尼(而非索拉非尼)分别显著下调了Cyclin B1和Mad2的表达(P<0.05);此外,这三个药物均显著下调了Cdc20的表达,其中瑞戈非尼的作用显著强于索拉非尼(P<0.05)。仑伐替尼和瑞戈非尼组的Cdc20表达水平分别下降到DMSO组的50.4%和46.8%,下降到索拉非尼组的72.2%和67%。与Cdc20的结果类似,仑伐替尼和瑞戈非尼组的Cyclin B1表达水平分别下降到DMSO组的59%和60.6%,下降到索拉非尼组的80.4%和82.5%)。3.2 P53信号通路BCL-x L、TSP-1、PAI-1和p53R2均分别被索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼显著下调(P<0.01)。此外,仑伐替尼和瑞戈非尼对BCL-x L和TSP-1表达的下调作用显著强于索拉非尼(P<0.05和P<0.01)。仑伐替尼组的TSP-1和PAI-1表达水平分别下降至DMSO组的38%和45.9%,下降至索拉非尼组的60.9%和68.7%(P<0.05)。3.3剪接体相关信号通路12个下调蛋白参与了剪接体信号通路。索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼显著下调了DDX5、DHX15和e IF4A3的表达(P<0.01),仑伐替尼对DHX15表达的下调作用显著强于索拉非尼(P<0.05)。WBP11、BUD31、Prp19、SF3A1和UAP56五个蛋白中,除SF3A1外索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别显著下调了其他四个蛋白的表达水平(P<0.05和P<0.01);此外,仑伐替尼和瑞戈非尼对BUD31表达的下调作用显著强于索拉非尼(P<0.01)。与DMSO相比,仑伐替尼和瑞戈非尼(而非索拉非尼)显著降低了SF3A1的表达水平达20%以上(P<0.05)。SPF30、Dib1、SART1和SNRPF四个蛋白中,除SNRPF外索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别显著下调了其他三个蛋白的表达水平(P<0.05和P<0.01)。索拉非尼和瑞戈非尼(而非仑伐替尼)显著降低了SNRPF的表达水平(P<0.05)。3.4 mRNA监控信号通路7个蛋白(PAPOLA、PAPOLB、e IF4A3、UAP56、HBS1L、PABPC1和PABPC1L)涉及m RNA监控信号通路。索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼分别显著下调了这7个蛋白(P<0.01),每个蛋白的下调程度在三个药物之间无统计学差异。3.5核苷酸切除修复信号通路以及DNA复制信号通路四种下调蛋白(CUL4A、Polε4、RFC2和PCNA)与哺乳动物核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)相关,六种下调蛋白质(PRIM1、Polε4、RFC2、PCNA、MCM3和MCM4)与DNA复制过程相关。NER过程中的CUL4A、Polε4、RFC2和PCNA表达水平,分别被索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼显著下调(P<0.05和P<0.01),其中仑伐替尼和瑞戈非尼下调PCNA表达的作用显著强于索拉非尼(P<0.05和P<0.01)。在DNA复制信号通路中,PRIM1、Polε4、RFC2、PCNA、MCM3和MCM4的表达水平,分别被索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼显著下调(P<0.01);其中瑞戈非尼下调PRIM1、PCNA和MCM3表达的作用以及仑伐替尼下调PCNA表达的作用,均显著强于索拉非尼(P<0.05和P<0.01);瑞戈非尼组的PRIM1表达水平分别降至DMSO、索拉非尼和仑伐替尼组的61.9%、77.8%和83.6%(P<0.01)。小结:IC_(50)浓度的索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼各自均下调了Huh-7细胞相同的419个蛋白,通过David在线平台富集得到前六位的通路依次是剪接体相关信号通路、DNA复制相关信号通路、细胞周期信号通路、m RNA监控信号通路、P53信号通路和核苷酸切除修复信号通路,共涉及33个下调差异蛋白;其中12个差异蛋白可能与仑伐替尼和瑞戈非尼减少S期Huh-7细胞,阻滞Huh-7细胞于G_0/G_1期以及诱发细胞凋亡的作用显著强于索拉非尼有关。33个下调差异蛋白中,有14个蛋白可成为评估和比较三个multi-RTK抑制剂单独或与其他治疗联合应用时的治疗效果并预测预后的参考指标,4个蛋白有望成为指导治疗并预测预后的潜在参考指标。其他15个蛋白是在人源性肝癌细胞首次发现的与multi-RTK抑制剂抗肝癌细胞增殖密切相关的信号分子蛋白;特别是其中的DHX15、PAPOLB和HBS1L三个蛋白,国内外尚未发现其与癌症的关联性。结论:1.在晚期肝细胞癌患者的治疗中,与索拉非尼相比,仑伐替尼可提高患者的ORR并延长PFS,但OS无获益。2.仑伐替尼和瑞戈非尼可能对人肝癌细胞DNA合成具有更强的抑制作用,导致更多的肝癌细胞阻滞于G_0/G_1期,同时减少了S期和G_2/M期细胞。与仅能诱导早期凋亡且作用最弱的索拉非尼相比,仑伐替尼、瑞戈非尼还可诱导肝癌细胞晚期凋亡和坏死,其中仑伐替尼诱导早期凋亡的能力最强,而瑞戈非尼诱导细胞坏死和Smoothened Agonist晚期凋亡能力更强。3.在干扰肝癌细胞蛋白质表达方面,仑伐替尼的作用最强,索拉非尼的作用最弱;此外,瑞戈非尼和仑伐替尼下调蛋白的作用更强。4.索拉非尼、仑伐替尼和瑞戈非尼的共享下调蛋白富集得到前六位的通路依次是剪接体相关信号通路、DNA复制相关信号通路、细胞周期信号通路、m RNA监控信号通路、P53信号通路和核苷酸切除修复信号通路,共涉及33个下调差异蛋白;其中12个差异蛋白可能与仑伐替尼和瑞戈非尼减少S期细胞,阻滞肝癌细胞于G_0/G_1期以及诱发细胞凋亡的作用显著强于索拉非尼有关。5.建议对于HCC患者,如果常规检测癌组织或血液样本中14个蛋白(PCNA、MCM3、MCM4、Mad2、Cdc20、TSP-1、PAI-1、DDX5、SF3A1、e IF4A3、PABPC1、CUL4A、RFC2和PRIM1)的表达水平,可以评估和比较三个multi-RTK抑制剂单独或与其他治疗联合应用时的治疗效果并预测预后;对于HCC患者,应该探索性检测癌组织或血液样本中4个蛋白(p53R2、Prp19、UAP56和SART1)的表达水平,以评估其是否可成为早期HCC的潜在标志物及患者接受多激酶抑制剂治疗时疗效和预后的潜在指标。其他15个蛋白是在人源性肝癌细胞首次发现的与multi-RTK抑制剂抗肝癌细胞增殖密切相关的信号分子蛋白;特别是其中的DHX15、PAPOLB和HBS1L三个蛋白,国内外尚未发现其与癌症的关联性;亟待开展深入细致的基础与临床研究。