背景乳腺癌(Breast cancer,BC)是全世界女性中最常见的癌症,也是导致全球女性死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)由于其高度的异质性是乳腺癌最易转移复发并且预后最差的亚型。由于缺乏相应的治疗受体,极少数TNBC患者从内分泌治疗或Her2靶向治疗中获益。因此,化疗仍然是TNBC治疗的主要治疗方式,例如以多柔比星(Doxorubicin,Dox)为代表的蒽环类经典化疗药物。然而,接受化疗的TNBC患者表现出频繁的化疗耐药性,导致化疗效果欠佳以及预后不良。目前,关于TNBC产生化疗耐药性的发生发展机制尚未完全阐明,化疗耐药以及后续引发的一系列并发症更是成为综合治疗面临的一个巨大挑战。因此,寻找能够增强TNBC化疗敏感性的潜在治疗靶点,对于提高患者的预后具有极其重要的临床意义。越来越多的证据表明,去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)通过对蛋白的去泛素化修饰调节细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤进展。含OTU结构域蛋白1(OTU Domain-Containing Protein 1,OTUD1)是去泛素化酶OTU家族的成员。最近的研究发现去泛素化酶OTUD1作为多种癌症的肿瘤抑制因子发挥作用。OTUD1在多种肿瘤中的表达水平显著下调,通过抑制与肿瘤恶性进展相关的信号通路进而参与调控肿瘤细胞的增殖转移、氧化应激以及化疗耐药等过程。虽然己有多项研究提示OTUD1参与调控恶性肿瘤的发生发展,但OTUD1在TNBC化疗耐药中发挥的作用及机制尚未明确。目的本研究中,我们旨在分析OTUD1在TNBC中的表达水平并探索它在TNBC化疗耐药中的作用及分子调控机制,为寻找TNBC获悉更多靶向治疗新靶点以及改善患者预后提供新的策略。方法1.利用生物信息学分析OTUD1在乳腺癌中的表达水平以及预后。2.利用慢病毒转染MDA-MB-231和BT549两种TNBC细胞系,构建OTUD1稳过表达和敲低的TNBC细胞株。3.利用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验检测OTUD1是否参与调控TNBC细胞的增殖能力。4.利用CCK-8细胞活力实验、流氏细胞术、Ki67染色、TUNEL染色分析OTUD1是否参与调控TNBC细胞对多柔比星的敏感性。5.利用免疫沉淀联合质谱分析OTUD1潜在的相互作用蛋白,利用蛋白质免疫共沉淀进一步明确OTUD1与P16的相互作用关系,利用免疫组织化学染色和Western bepigenetic biomarkerslot分析OTUD1和P16在TNBC组织中的表达水平以及两者的相关性。6.利用瞬时转染实验、Western blot实验、CCK-8细胞增殖与活力实验以及流式细胞术检测P16是否能够逆转OTUD1对TNBC细胞Dox敏感性的调控。7.利用裸鼠荷瘤模型进一步评估OTUD1体内调控TNBC对多柔比星敏感性的作用。结果1.OTUD1在乳腺癌中的表达水平及预后特征:通过TCGA数据库、GSE61304、GSE76250、GSE22820和免疫组化分析发现,与正常乳腺组织相比,OTUD1在selleck产品乳腺癌组织中低表达并且TNBC组织中显著低表达。生存分析表明OTUD1低表达与患者的无病生存率(DFS)、无进展生存率(PFS)、总生存率(OS)、无复发生存率相关(RFS)呈显著负相关,OTUD1高表达与具有新辅助化疗史的乳腺癌患者的无复发生存率呈显著正相关。2.OTUD1抑制TNBC细胞增殖并增强TNBC细胞对DOX的化疗敏感性:RTq PCR和Western blot检测结果显示OTUD1在TNBC细胞中成功敲低或过表达。体外功能学实验结果表明,过表达OTUD1显著抑制TNBC细胞的增殖,克隆形成能力并增强DOX对TNBC细胞的细胞毒性作用,增强多柔比星诱导的细胞凋亡并上调凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的水平。相反,敲低OTUD1显著促进TNBC细胞的增殖,克隆形成能力,抑制DOX对TNBC细胞的细胞毒性作用,抑制多柔比星诱导的细胞凋亡并下调凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9的水平。3.OTUD1增强体内TNBC细胞对DOX敏感性:同时给予生理盐水或同时给予化疗药物DOX后,OTUD1过表达组裸鼠移植瘤的体积瘤重均低于对照组,Ki67染色强度较低且TUNEL阳性细胞率较高。并且在OTUD1过表达联合化疗药物DOX组中,裸鼠移植瘤的体积瘤重在四个组别最低,Ki67染色强度最弱,TUNEL阳性细胞率最高。4.OTUD1-P16轴可能作为调控TNBC细胞对DOX敏感性的关键信号轴:免疫沉淀联合质谱分析表明P16可能是OTUD1潜在的互作蛋白,免疫共沉淀进一步验证OTUD1与P16相互作用。此外,TNBC组织标本免疫组化结果显示OTUD1与P16的蛋白表达水平呈正相关。Western blot检测结果发现过表达OTUD1上调P16表达,而敲低OTUD1则抑制P16表达。功能回复实验结果表明敲低P16可逆转OTUD1过表达MDA-MB-231细胞对DOX的敏感性,而过表达P16则增加了OTUD1敲低的MDA-MB-231细胞对DOX的敏感性。结论及意义OTUD1在TNBC中表达水平显著降低且低表达与患者的不良预后密切相关。体外实验结果表明,OTUD1过表达可明显抑制TNBC细胞增殖并增加TNBC细胞对多柔比星的敏感性,而OTUD1敲低的结果与之相反。动物实验结果表明,OTUD1过表达可增强体内TNBC细胞对DOX的化疗敏感性。机制上,OTUD1与P16相互作用,通过上调P16的表达抑制TNBC细胞增殖并增强TNBC细胞对DOX的化疗敏感性。本研究针对OTUD1在TNBC化疗耐药中的作用及机制进行探讨,首次提出了OTUD1通过靶向调控P16表达参与TNBC化疗敏感性的新机制,有望为乳腺癌的新辅助化疗和靶向治疗提供新的思路。