由于气候变暖,高温已成为全球关注的热点问题之一。高温热害在多国家多地区频繁发生,严重影响了植物的正常生长发育和经济作物的产量和品质,甚至会导致VX-445植株死亡。因此,研究如何提高植物的高温耐受性具有重要的意义。褪黑素(Melatonin,MT)是一种吲哚类物质,广泛存在于植物体内并参与调控植物非生物胁迫的耐受性。银杏是著名的观赏树种,在全国各地广泛分布,具有重要的园林应用价值。夏季高温胁迫不仅会导致银杏叶片发黄焦枯、观赏价值下降,甚至会造成银杏大树和古树的死亡。本研究前期发现外源褪黑素处理可有效缓解银杏高温胁迫造成的伤害,在此基础上,筛选适宜浓度外源褪黑素,进行褪黑素合成基因家族鉴定与表达分析,确定褪黑素合成基因GbSNAT响应高温胁迫和外源褪黑素处理,进一步研究GbSNAT功能及其调控高温耐受性的作用机制。主要研究结果如下:(1)对3个月和1.5年的银杏幼苗进行不同浓度的MT处理,结果显示:3个月银杏幼苗在高温下,高剂量和低剂量MT(0、50和200 μmol)处理组叶片黄化更多枯萎程度严重,而中剂量(100和150 μmol)MT可减缓高温诱导的叶片黄化。进一步用中剂量(100和150μmol)MT处理1.5年生银杏幼苗,发现100 μmol MT可有效减缓叶片黄化枯萎。光合生理指标测定结果显示,高温下叶片叶绿素总含量、净光合速率和水分利用率呈下降趋势,100和150μmolMT处理下三者均显著高于Control,其中100μmolMT组叶片光合能力最强;高温下蒸腾速率呈上升趋势,100 μmolMT组的蒸腾速率低于Control和150μmolMT组。逆境相关酶活性测定结果显示,100μmolMT处理组SOD和POD活性最高,MDA与H2O2含量最低。热激转录因子HSFs表达分析发现,MT处理下大部分HSFAs和HSFBs基因显著上调。此外,外源MT和高温处理均可促进银杏内源MT含量增加,并响应高温胁迫。以上结果表明,外源褪黑素处理可增强高温下植株的光合能力和抗氧化物酶活性,降低蒸腾速率,有效缓解高温胁迫。(2)通过基因家族分析和保守结构域鉴定,在银杏基因组中共鉴定出MT合成基因:6个TDCs、14个T5Hs、9个COMTs、7个ASMTs和1个SNAT。进化分析显示多个TDCs、T5Hs、COMTs及ASMTs家族存在广泛的串联重复事件;启动子顺式作用元件分析显示,银杏MT合成基因包含响应光、胁迫、激素以及生长发育等元件结合位点。基因表达分析发现多个基因响应MT和高温胁迫,其中GbSNAT高度响应高温胁迫和外源MT处理,表明GbSNAT是MT合成且响应高温的关键候选基因。(3)组织特异性表达分析显示GbSNAT在银杏叶片中相对表达量最高。构建35S::GbSNAT-GFP过表达载体,烟草亚细胞定位发现GbSNAT定位于叶绿体。瞬时过表达转化银杏愈伤,MT含量显著增加;构建PGEX-6p-GbSNAT原核表达载体,体外酶促实验显示GbSNAT蛋白可以催化5-甲氧基色胺生成MT,表明GbSNAT是银杏MT合成的关键基因。(4)转基因拟南芥植株表型分析发现,转基因幼苗根长明显高于对照(Col-0)。对Mechanistic toxicologyCol-0、snat突变体和转基因苗进行40℃热激处理,结果显示GbSNAT转基因苗存活率显著高于Col-0和snat突变体。长期耐热性试验(38℃)显示转基因植株叶片受胁迫程度明显低于Col-0和snat突变体;叶绿素a/b含量、净光合速率以及SOD活性显著高于Col-0和snat突变体,而MDA含量和活性氧(O2·-)积累均明显少于Col-0和snat突变体。以上结果表明GbSNAT可通过增强植株的光合作用和降低活性氧的积累,提高植株耐高温的能力。(5)通过酵母双杂筛选出与GbSNAT互作蛋白Gb_16001,进化树分析确定Gb_16001与AtDEG5(光系统Ⅱ的蛋白酶)同源,命名为GbDEG5。通过酵母双杂(Y2H)和萤火素酶互补实验明确GbSNAT与GbDEG5存在相互作用。表达分析发现,外源MT和高温处理均可诱导GbDEG5基因显著上调表达,暗示GbSNAT可能协同GbDEG5共同参与调控银杏的高温耐受性。综上,外源MT处理可以有效增强银杏高温耐受性,主要通过内源褪黑素合成增加、抗氧化酶活性增强、光合作用提高、热激因子的表达激活,以缓解高温胁迫伤害。GbSNAT是银杏MT合成通路上的关键基因,有效促进MT合成,提高植株的耐热性。GbSNAT及互作蛋白GbDEG5响应MT处理和高温胁迫,共同参与调控银杏的高温耐受性。本研究结果将为褪黑素缓解银杏高温伤害提供重要的理论指导,也为植物高温胁迫耐热性研究提供参考。