沙海蜇(Stomolophus meleagris,S.meleagris)是中国、韩国和日本沿海地区主要的大型致伤水母之一,其触手中的生物毒素具有包括皮肤毒性、心血管毒性、神经毒性和肌肉毒性等在内的多种毒理学效应,每年造成大量的蜇伤事件,对公众健康安全构成巨大威胁。皮肤中毒症状是患者蜇伤后最直接最显著的表现,临床称为“水母皮炎”。水母皮炎的皮损从红斑、丘疹、风团到水疱、溃疡、坏死,轻重各不相同,并伴有剧烈疼痛和瘙痒,甚至出现严重的血管性水肿和过敏性休克。由于水母毒素成分多样,致病机制复杂,目前对于其皮肤毒性机理研究不足、认识尚浅,缺乏针对性和高效的治疗药物,这已成为目前水母蜇伤防治领域面临的主要问题。近年来,许多传统药材和植物提取物因其药理学活性丰富多样、天然安全,并对蛇毒、水母毒素等多种生物毒素具有良好的拮抗作用等优点得到了研究人员的广泛关注。这一点激发我们去寻找我国传统药物中潜在的可以拮抗沙海蜇毒素皮肤毒性,并用于治疗水母皮炎的有效药物。丹酚酸B(Salvianolic acid B,SAB)又称为丹参酚酸乙,是我国传统中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎中的主要水溶性复合物之一,具有显著的抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗细胞凋亡、保护微血管内皮细胞等多种药理活性,对心、脑、肝、肺、肾等多个器官都具有保护作用。曲克芦丁(Troxerutin,TRX)是天然提取物芦丁经羟乙基化后形成的半合成黄酮类化合物,研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循环、保护血管内皮细胞及组织细胞,降低毛细血管通透性等多种药理活性。然而,针对水母毒素引起的体内外皮肤毒性损伤,这两种药物是否具有较好的干预和保护效应,目前国内外尚未有相关研究报道。因此,在本研究中我们使用含有大量水母毒素的沙海蜇触手提取物(tentacle extract,TE)分别在细胞水平构建人表皮角质形成细胞Ha Ca T中毒损伤模型,在动物水平构建小鼠足掌中毒肿胀模型,分析和评价沙海蜇TE的体内外皮肤毒性,探究其毒性损伤机理。然后通过皮内给药、腹腔给药以及与细胞共孵育的方式,探究丹酚酸B和曲克芦丁对TE介导的体内外皮肤毒性损伤的干预和保护效应,为进一步筛选和研制治疗水母皮炎的针对性药物提供新的思路和方向。第一部分:丹酚酸B和曲克芦丁对沙海蜇TE体外皮肤损伤的保护作用研究目的:通过构建沙海蜇TE介导的Ha Ca T细胞中毒模型,分析与评价TE体外皮肤毒性和潜在机理;并探究丹酚酸B和曲可芦丁对沙海蜇TE介导的体外皮肤毒3-MA价格性损伤的干预和保护效应,分析和阐述其可能的作用机制。方法:1.通过自溶、过滤、离心、透析制备沙海蜇TE,并使用蛋白检测试剂盒检测其蛋白浓度作为TE浓度。2.选择不同浓度TE与Ha Ca T细胞共孵育,采用CCK8法检测细胞活力;通过流式细胞术和荧光染色检测细胞凋亡水平,评价TE的皮肤细胞毒性;随后Smoothened Agonist使用方法选择10μg/m L TE构建Ha Ca T细胞中毒模型,利用ELISA技术检测中毒模型0~12 h内不同时间点细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平以及氧化应激指标活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平。3.选择不同浓度SAB和TRX和30μg/m L TE混合溶液与Ha Ca T细胞共孵育,采用CCK8法检测细胞活力;通过流式细胞术和荧光染色检测细胞凋亡水平,探究SAB和TRX对TE细胞毒性的拮抗能力;随后设阴性对照组、TE模型组、药物干预组、药物内参组,利用ELISA技术检测各组在12 h时细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平及氧化应激指标ROS和MDA水平。结果:1.沙海蜇TE对Ha Ca T细胞具有剂量依赖性的体外细胞毒性,细胞活力与TE浓度成反比,LC50(Lethal Concentration 50%)=28.3μg/m L;细胞凋亡实验结果显示TE能明显诱导细胞凋亡,导致细胞坏死,并存在剂量依赖性;ELISA结果显示TE模型组细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α以及氧化应激指标ROS和MDA水平均呈现时间依赖性升高,在8 h~12 h之间达到峰值,趋于稳定。2.丹酚酸B和曲克芦丁这两种药物可以有效拮抗TE对Ha Ca T细胞的细胞毒性,显著提高细胞活力,且具有剂量依赖性;细胞凋亡实验结果显示SAB和TRX可以显著降低TE介导的Ha Ca T细胞凋亡水平;ELISA结果显示SAB和TRX可以显著降低TE模型组细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平,显著降低细胞内ROS和MDA水平,差异有统计学意义。第二部分:丹酚酸B和曲克芦丁对沙海蜇TE体内皮肤损伤的保护作用研究目的:通过构建沙海蜇TE介导的小鼠足掌中毒肿胀模型,分析与评价TE体内皮肤毒性和潜在机理;并探究丹酚酸B和曲可芦丁对沙海蜇TE介导的体内皮肤毒性损伤的干预和保护效应,分析和阐述其可能的作用机制。方法:1.通过自溶、过滤、离心、透析制备沙海蜇TE,并使用蛋白检测试剂盒检测其蛋白浓度作为TE浓度。2.将ICR小鼠随机分为对照组、不同剂量TE组;小鼠右侧足掌皮内注射50μL生理盐水(Normal saline,NS)和不同剂量TE(5μg、15μg、50μg)为对照组和不同剂量TE组(对侧足掌无处理),测量并记录小鼠右侧足掌在0~24 h内的足掌厚度变化,计算足掌肿胀百分比,并进行皮肤刺激反应评分。3.随后选取50μg TE构建小鼠足掌中毒肿胀模型,HE染色观察各组小鼠足掌在1 h、12 h、24 h的皮肤组织病理变化;ELISA检测TE模型组小鼠0~24 h内不同时间点血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平及氧化应激指标ROS和MDA水平。4.将ICR小鼠随机分为对照组、TE模型组、TE+药物皮内注射组、TE+药物腹腔注射组;小鼠右侧足掌皮内注射50μL NS、TE、TE+不同浓度药物混合溶液为对照组、TE模型组、TE+药物皮内注射组;预先腹腔注射SAB或TRX,0.5 h后足掌注射TE为TE+药物腹腔注射组。测量并记录各组小鼠足掌在0~24 h内的厚度变化,计算肿胀百分比,并进行皮肤刺激评分;HE染色观察足掌皮损在12 h时的组织病理变化;ELISA检测小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平以及氧化应激指标ROS和MDA水平。结果:1.沙海蜇TE具有明显的体内皮肤毒性。与对照组小鼠相比,TE模型组小鼠足掌出现明显的中毒性肿胀,皮肤刺激评分显著升高,并存在剂量依赖性;HE染色可见TE组小鼠足掌真皮显著水肿,胶原纤维分离淡染,真皮内大量毛细血管扩张充血、出血,真皮及皮下可见中性粒细胞和淋巴细胞为主的混合炎细胞密集浸润;ELISA结果显示TE模型组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平以及氧化应激指标ROS和MDA水平均呈时间依赖性升高,并在12 h~24 h之间达到峰值,趋于稳定。2.与TE组相比,丹酚酸B和曲克芦丁这两种药物通过皮内注射和预先腹腔注射两种给药方式均有效降低了不同时间点小鼠足掌肿胀百分比和皮肤刺激评分:HE染色显示SAB和TRX组均明显改善了TE引起的真皮层水肿,胶原纤维分离淡染,真皮内毛细血管扩张充血、出血及混合炎细胞浸润的炎症性病理改变;ELISA结果显示SAB和TRX组均显著降低了小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平以及氧化应激指标ROS和MDA水平,其中SAB和Tupper genital infectionsRX腹腔注射组的降低效果略优于皮内注射组。结论:1.沙海蜇TE在动物水平和细胞水平均具有明显的皮肤毒性作用,其毒性损伤机制与炎症和氧化应激损伤相关;可能通过上调炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平,诱导剧烈炎症反应;并刺激大量活性氧ROS产生释放,引发脂质过氧化反应,显著升高MDA水平,造成组织和细胞氧化应激损伤,从而进一步诱导和加剧炎症反应而实现。2.丹酚酸B和曲克芦丁对沙海蜇TE介导的体内外皮肤毒性损伤均具有较好的保护作用,其机制可能与两种药物显著的抗炎和抗氧化损伤活性相关;可能通过下调炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平,降低细胞和组织炎症反应水平;并抑制ROS的大量产生释放,抑制脂质过氧化反应,显著降低MDA水平,从而改善组织和细胞氧化应激损伤而实现,是潜在的治疗水母皮炎的有效药物。