糖脂代谢紊乱是多种代谢性疾病的核心病理机制,目前还没有公认的方法和药物来全面改善和治疗,临床常用的降糖降脂药物长期用药的副作用都较大,急需寻求新的治疗药物。HCV核心蛋白结合蛋白(Hepatitis C virus core-binding protein6;HCBP6)是近年来新发现的可调控糖、脂肪合成的重要靶点,其在机体中的表达与甘油三酯及胆固醇密切相关,它会根据二者含量的变化调整自身分泌。已有文献报道,人参皂苷Rh2能诱导HCBP6表达,有效改善糖脂代谢紊乱,但是Rh2为稀有皂苷,含量极低,至今不能全合成,成药可行性低。临床实践和现代研究表明,人参、三七、苦瓜、绞股蓝、青钱柳、玉竹、罗汉果和黄精8味中草药均具有良好的调节糖脂代谢作用,而皂苷类成分是其活性成分。因此,本文拟以以上8味中草药为研究对象,以HCBP6为主要作用靶点,利用蛋白建模及分子对接等虚拟筛选技术,从8味中药中筛选潜在活性化合物并加以验证,以期发现疗效确切、机制明确的调节糖脂代谢的的先导化合物。目的:以新发现的HCBP6蛋白为主要作用靶点,通过蛋白建模、虚拟筛选和体内外试验相结合,从8味常用中草药中筛选具有调节糖脂代谢作用的疗效确切、机制明确的先导化合物。方法:采用细胞试验,通过PCR和WB检测考察以上8味中药总皂苷部位对HCBP6基因和蛋白质的调控作用。利用数据库和文献报道,收集整理8味中药中的皂苷和苷元成分,构建小分子库。分别通过SWISS同源建模法、trRosetta从头建模法、I-TASSER穿线法以及ROBETTA综合法预测HCBP6蛋白结构,用于虚拟筛选。为了提高筛选的可靠性,同步选择与HCBP6密切相关的具有调节糖脂代谢作用的5个关键靶点(AMPK、FXR、FoxO1、SIRTMedical apps1、FGF21)用于虚拟筛选。在PDB数据库中搜索以上5个关键蛋白名称后,选择分辨率高,结构内含有与皂苷类化合物具有相似结构的小分子配体的蛋白受体结构作为受体结构。使用Discovery Studio软件中CDOCKER模式或LibDock模式将上述小分子库中的分子结构和以上6个蛋白结构进行分子对接,筛选得到潜在活性成分。利用游离脂肪酸和单糖建立体外糖脂代谢紊乱模型,筛选最佳造模条件。采用优选的最佳造模条件建立HepG2体外糖脂代谢紊乱模型,通过测定甘油三酯含量和葡萄糖消耗量,检测虚拟筛选得到的潜在活性分子的体外活性,并就测定结果进行构效关系分析。通过高糖高脂饲料喂养构建C57BL/6J小鼠糖脂代谢紊乱模型,对体外试验中筛选得到的活性分子再经体内试验进行进一步的活性验证,监测小鼠体重、死亡情况,对其空腹血糖、脏器比及生化指标进行检测。最后通过PCR 及 WB 试验检测活性成分对 HCBP6、SREBP1、SREBP2、GLUT1、GLUT4、G6pase及PEPCK的mRNA和蛋白表达的影响,以阐释其作用机制。结果:1.与对照组相比,8味中药总皂苷部位在10mg·mL-1浓度下均对细胞生长无显著影响,而且绞股蓝、三七和人参总皂苷在高浓度下还表现出促进细胞生长的作用。PCR实验结果显示,与对照组比较,人参1 000μg·mL-1组,苦瓜200 μg·mL-1 组,绞股蓝 50、200、1000 μg·mL-1 组以及三七 100 μg·mL-1 组 HCBP6基因表达显著升高(P<0.05);比较而言,绞股蓝总皂苷组上调HCBP6基因的作用最好。WB检测结果显示,与对照组相比,人参500、1 000μg.mL-1组可显著上调HCBP6蛋白的表达(P<0.05),其他不同浓度的7种中药总皂苷均可使HCBP6蛋白的表达增加,但差异并不显著。各药物组对HCBP6 mRNA及蛋白表达均未表现出明显的剂量依赖性。2.经过去重处理后,共从8味中药中收集整理了 1308个皂苷及苷元类成分,建立了皂苷类成分小分子库。四种蛋白建模方法比较,ROBETTA综合法预测的HCBP6蛋白结构最合理,其3D-1D评分高于0.2的氨基酸占比为85.19%(>80%代表结构合理),Ramachandran图中处于合理区域的氨基酸占比为95.1%(>90%代表结构合理),可用于下一步试验。利用DS软件,以CDOCKER模式或LibDock模式进行分子对接,共筛选得到193个潜RAD001体内实验剂量在活性小分子,包括130个三萜,63个甾体;三萜中有52个苷元,78个皂苷;甾体中有31个苷元,32个皂苷。3.囿于对照品的可及性和经费的限制,从虚拟筛选获得的193个化合物中共选择了 59个成分用于体外活性验证。HepG2细胞糖脂代谢紊乱模型的最佳造模条件为:1mM油酸+0.5mM棕榈酸+10mM葡萄糖+15mM果糖作用24h即可。体外活性实验结果表明,24个化合物(包括21个三萜,3个甾体)可显著减少细胞内TG的含量(P<0.01);49个化合物(包括38三萜,11个甾体)可显著提高葡萄糖的消耗量(P<0.05);共有23化合物可同时降低细胞内TG含量并显著提高葡萄糖的消耗量。最终筛选得到14个体外活性成分,分别是:ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol(1)、人参皂苷 Rb3(3)、gypenoside Ⅸ(5)、23,24-二氢葫芦素F-25-乙酸酯(12)、葫芦素B(14)、葫芦素Q1(15)、人参皂苷 Rh4(20)、人参皂苷 Rh2(21)、3,29-二苯甲酰基栝楼仁二醇(24)、KaravilosideⅪ(42)、人参皂苷Rg6(43)、人参皂苷Rk2(44)、人参皂苷Rb2(49)及人参皂苷Rk1(52)。构效关系分析结果表明,三萜类化合物不管在数量还是作用上均优于甾体类化合物;皂苷类成分在整体效果上优于皂苷元;达玛烷型四环三萜类化合物可能在糖脂代谢类疾病防治中更有优势;皂苷类化合物中,3位、6位、20位有无糖取代及糖的类型对药效有不同影响;三萜皂苷元的3位羟基被羰基取代时,化合物活性会减弱。PCR结果显示,以上14个活性化合物均可显著降低HCBP6mRNA表达量(P<0.01);除化合物12、20外,其余化合物均可显著降低 G6pase、PEPCK mRNA 表达量(P<0.01);化合物 1、3、12、20、43、44、49、52可显著增加GLUT1 mRNA的表达量(P<0.01);除化合物20外,其余化合物均可不同程度降低SREBP1、SREBP2 mRNA表达量(P<0.01)。WB结果显示,化合物1、3、42、43、52所有浓度均可减少HCBP6表达,统计无显著性差异;化合物3、5、12、14、20、42所有浓度均可显著上调GLUT1蛋白表达(P<0.01);化合物14、15、20所有浓度均可显著上调GLUT4表达(P<0.01);化合物12、15、20所有浓度均可显著下调SREBP1表达(P<0.01);化合物5、14、15、20、49所有浓度均可显著下调SREBP2表达(P<0.01);除化合物15以及44外,其他化合物所有浓度均可显著下调PEPCK表达(P<0.01);化合物3、12、15、21、42、43、49所有浓度均可显著下调G6pase表达(P<0.01)。4.同样囿于对照品的可及性和经费的限制,从14个细胞试验证明有活性的化合物中选择其中的7个成分[gypenoside Ⅸ(5)、23,24-二氢葫芦素F-25-乙酸酯(12)、葫芦素B(14)、葫芦素Q1(15)、3,29-二苯甲酰基栝楼仁二醇(24)、人参皂苷Rg6(43)、人参皂苷Rk2(44)]用于体内药效评价。采用高糖高脂饲料饮食诱导C57BL/6J小鼠糖脂代谢紊乱模型进行体内活性评价,分为空白组、模型组、二甲双胍组(200mg·kg-1)、以及受试物高剂量(60mg·kg-1)和低剂量(30mg·kg-1)组。造模成功后,连续给药1个月,监测小鼠体重和死亡情况,每周检测空腹血糖,给药结束后检测脏器比和生化指标,结果显示14号化合物(葫芦素B)高、低剂量组小鼠全部死亡;二甲双胍组和15号化合物组体重降低最多;12、24、43和44号化合物组体重增加明显;除化合物5高低剂量、12低剂量及43高剂量组外,全部给药组均有显著降糖作用(P<0.05);除化合物12高剂量、24低剂量及44低剂量组外,全部给药组均有显著降脂作用,但差异无统计学意义。与模型组相比,15号化合物(葫芦素Q1)有显著降糖降脂作用(P<0.05);但肝功、肾功指标及脏器比结果显示,15GSK J4使用方法对小鼠有明显的肝肾毒性,其余给药组未见肝肾毒性。此外,脾、胸腺脏器比结果显示,化合物24、43可改善小鼠免疫功能。PCR及WB试验结果表明,与模型组比较,除12、15号之外的其他5个成分均可上调HCBP6mRNA及蛋白表达,其中化合物24、43、44的上调有统计学意义(P<0.05);化合物43可显著上调G6pase mRNA及蛋白表达(P<0.05);所有给药组均可下调SREBP1和SREBP2 mRNA及蛋白表达(P<0.01);除化合物15外,所有给药组对GLUT1及GLUT4 mRNA及蛋白表达量均有增加趋势,但差异无统计学意义。结论:1.人参、三七、苦瓜、绞股蓝、青钱柳、罗汉果、玉竹和黄精的总皂苷部位均有上调HCBP6基因和蛋白表达的作用,通过干预HCBP6的表达而发挥调节糖脂代谢作用可能是这8味中药发挥药效的机制之一。2.通过蛋白建模-分子对接-体内外活性验证从人参等8味中药中筛选得到3个具有调节糖脂代谢的先导化合物,分别是3,29-二苯甲酰基栝楼仁二醇(24)、人参皂苷Rg6(43)和人参皂苷Rk2(44)。