血红白叶藤(Cryptolepis sanguinolenta(Lindl.)Schlechter)是广泛分布在非洲的传统草药,在西非传统医药中占有重要地位,其具有抗炎、降血脂、抗菌、抗疟、抗肿瘤等多种药理作用。近年来,课题组对血红白叶藤的主要有效成分新白叶藤碱、白叶藤碱和异白叶藤碱等进行了系统的结构优化与抗菌活性评价研究,并首次发现了新白叶藤碱对植物病原真菌具有良好的抗菌活性,以此为先导化合物,通过结构衍生与优化后得到了抗菌谱更广、抗菌活性更优和毒性更低的候选化合物Z24。据此,本论文旨在研究和明晰候选先导化合物Z24对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)的作用机制及其靶标,为进一步生物合理性设计基于新白叶藤碱类生物碱的抗菌剂奠定基础。本研究以B.cinerea Pers.为供试菌株,通过DACeralasertib生产商RTS和LC-MS/MS联用技术对Z24的直接作用靶标进行鉴定,并借助酶学、抗体制备、分子对接、转录组学、可变剪接、代谢组学和外源施加代谢物等手段对鉴定得到的疑似靶标蛋白进行了系统深入的研究。研究的主要内容和结果如下:1、新白叶藤碱衍生物Z24为高效、低毒的抗真菌剂体外活性研究结果发现,相较新白叶藤碱而言,Z24对4种重大植物病原真菌表现出更加优异的抗真菌活性,其中Z24对B.cinerea Pers.的抗菌活性最优(EC_(50)=0.56μg/m L),优于阳性对照药嘧霉胺(EC_(50)=4.45μg/m L)。在活体实验中,Z24在100μg/m L浓度下能够显著抑制B.cinerea Pers.对番茄果实的侵染,具有较好的保护作用。盆栽实验中,100μg/m L Z24显著抑制B.cinerea Pers.对黄瓜叶片的侵染,其保护作用可达到与嘧霉胺相当的防治效果。与此同时,Z24能够浓度依赖性抑制B.cinerea Pers.孢子的萌发,并诱导孢子中活性氧的积累。Z24也显著诱导了B.cinerea Pers.菌丝细胞的凋亡,并造成菌丝细胞膜的完整性丢失和细胞显微结构的破坏。此外,Z24在HIEC细胞、HL7702细胞和GES-1细胞中具有比新白叶藤碱更低的细胞毒性,其中在HIEC细胞和GES-1细胞中的毒性低于嘧霉胺。大鼠急性经口毒性LD_(50)>2000 mg/kg,并且2000 mg/kg Z24未造成大鼠组织病理学的改变,也未引起大鼠血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、尿素氮和谷丙转氨酶肝肾损伤指标的异常变化。最后,Z24也表现出相对较低的植物毒性。2、基于DARTS和LC-MS/MS技术获得了Z24作用于灰葡萄孢菌的疑似靶标蛋白Bcthi4采用DARTS、考马斯亮蓝染色、银染和质谱分析等技术手段鉴定出了Z24的直接作用靶标蛋白-硫胺噻唑合酶(Bcthi4),其中Bcthi4蛋白在鉴定列表中相对丰度占比为37.11%。随后利用docking法验证了Z24与Bcthi4同源蛋白有较好的结合能力,对接评分为-4.302 Kcal/mol。KEGG分析发现,Z24富集到的这类蛋白主要参与代谢途径、次级代谢产物的生物合成、核糖体、抗生素的生物合成、不同环境中微生物的代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成、糖酵解/糖原异生和丙酮酸代谢等生物过程。3、确证了灰葡萄孢菌Bcthi4蛋白为Z24的直接作用靶标蛋白在靶标蛋白的确证中,首先通过参考Gen Bank已公布的B.cinerea B05.10Bcthi4基因序列(Gene ID:5430120)设计引物,利用PCR技术扩增灰葡萄孢菌Bcthi4基因后连接至p ET-B2M亚克隆载体,构建了重组质粒Bcthi4-p ET-B2M。将Bcthi4-p ET-B2M质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导培养后获得了纯度较高的Bcthi4重组蛋白。动物免疫后,经间接ELISA和Western blotting检测发现,制备所得的灰葡萄孢菌Bcthi4基因兔多克隆抗体具有灵敏度高和特异性强的特性,可用于下一步的Western blotting检测。然后通过Western blotting法对Z24和Bcthi4的结合反应进行了特异性检测,为此,我们设计并应用了CETSA和DARTS技术确认了Z24与Bcthi4蛋白的结合反应,发现Z24与Bcthi4蛋白具有较好的结合活性,且具有浓度依赖性。此外,0.05μg/m L和0.1μg/m L Z24能显著抑制B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10 Bcthi4活性。综上所述,通过Western blotting和ELISA等方法的联合验证,证实硫胺噻唑合酶(Bcthi4)确实为Z24的直接作用靶点。4、Z24通过影响硫胺素焦磷酸与Bcthi4核糖开关的结合来调控硫胺素代谢Bcthi4作为硫胺素生物合成途径中的核糖开关位点,在真菌中是通过可变剪接的方式进行基因的表达调控。差异可变剪接基因的KEGG Pathway分析发现,富集最显著的通路确实为硫胺素代谢途径,并且有3个差异可变剪接基因富集到硫胺素代谢通路,包括Bcthi4、Bcthi6和Bcrpb8,表明它们在硫胺素代谢中发挥关键作用。值得注意的是,负责硫胺素噻唑环合成的核糖开关Bcthi4中检测到了显著上调的可变剪接事件(Alternative Splicing,AS),且呈现A5SS剪接模式,表明Z24处理引起灰葡萄孢菌基因Bcthi4前体m RNA的选择性剪接,并造成Bcthi4前体m RNA剪接的增加。此外,灰葡萄孢菌在Z24胁迫生长过程中诱导了靶标基因Bcthi4的高水平表达,表明菌丝细胞处于硫胺素饥饿的状态,通过提高硫胺素合成相关基因的表达水平才能够部分恢复灰葡萄孢菌的生长,其作用方式与市售真菌剂戊唑醇类似。上述结果表明,Z24通过影响TPP与Bcthi4核糖开关的结合来进一步调控灰葡萄孢菌的硫胺素代谢过程。5、Z24是一种硫胺素生物合成通路的抑制剂向含有Z24的Pinfections: pneumoniaDA平板和PD水培养基中外源施加硫胺素后显著降低了Z24对B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10的抑制活性,而硫胺素本身不能够促进灰葡萄孢菌的生长,从而表明Z24是一种硫胺素生物合成通路的抑制剂。此外,B.cinerea Pers.和B.cinerea B05.10在Z24胁迫生长下均发生密集生长后,菌丝细胞内硫胺素及其活性形式硫胺素焦磷酸随化合物浓度的增加呈现不断积累的变化趋势,表明菌丝细胞是处于硫胺素饥饿的状态,只有通过积累硫胺素等代谢产物才能够恢复灰葡萄孢菌的生长。此外,非靶向代谢组学表明,硫胺素代谢异常进一步影响了灰葡萄孢菌的次生代谢物的生物合成、氨基酸生物合成、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、ABC转运蛋白、氨基酰基-t RNA生物合成等生物过程。6、基于虚拟筛选获得了潜在的Bcthi4小分子抑制剂灰葡萄孢菌Bcthi4蛋白的三维结构目前还未被解析,通过前期的文献调研发现,Bcthi4的Alpha Fold预测三维结构评分为70分以上的占比很高,表明Alpha Fold预测的结构可靠性良好(Alpha Fold ID:AF-A0A384JNK6-F1)。因此,通过Bcthi4的Alpha Fold预测结构(其结合口袋选自Bcthi4蛋白与底物的结合口袋,其关键氨基酸为CYS89/GLU110/GLY118/VAL183/HIS234/MET286等)进行计算机虚拟筛选。通过Schr?dinger软件的Lig Prep Module模块将78.8 K个化合物的2D格式进行加氢、能量优化等处理,输出3D结构进行虚拟筛选,最终获得了与靶蛋白Bcthi4结合力强的Top 200小分子化合物。将打分前5名化合物(Z1601701772、Z2506212851、Z1738460435、HY-Q01831、HY-Q03084)与Bcthi4蛋白的结合模式进行2D、3D作图,进一步分析两者间的相互作用模式VX-765和预测小分子配体的生物活性,为进一步探索基于Bcthi4蛋白的全新化学实体的设计合成与抗真菌药物开发奠定基础。