与传统方法相比,单分子荧光检测技术具有精度高、背景低、灵敏度高等优点。单分子荧光检测技术已广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等多种生物标志物的检测,在药物开发和疾病早期诊断genetics polymorphisms方面具有广阔的应用前景。本文基于单分子计数开发了两种灵敏检测端粒酶、脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)的荧光生物传感器。研究内容如下:(1)我们开发了一种将端粒化诱导连接-转录循环驱动的级联信号放大与单分子检测相结合,用于简单而灵敏地测量癌细胞中端粒酶的方法。端粒酶是一种核糖核蛋白的复合物,在正常的人类体细胞中不活跃,但在绝大多数癌症细胞中被激活,以保持其无限增殖和永生表型,使端粒酶成为一个有前景的诊断和治疗靶点。在本工作中,端粒酶的存在催化将串联重复序列(TTAGGG)_n加到端粒酶底物(telomerase substrate,TS)的3′-OH上,生成长链端粒延伸产物(telomeric extension product,TEP)。产生的TEP激活连接-转录selleckchem Crizotinib循环,使目标物能够转化为大量的报告RNA。释放的报告RNA随后启动下游DSN辅助的信号探针的循环切割,这些信号探针可以作为信号转导和放大器来释放大量的Cy5荧光团,这些荧光团可以通过单分子检测来简单地定量,作为端粒酶活性的反映。通过多阶段扩增循环输出的强大信号以及单分子检测固有的高信噪比,该方法具有很高的检测性能,不仅可以区分癌细胞和正常体细胞,而且可以定量检测低至单个He La细胞的端粒酶活性。此外,该方法可用于端粒酶抑制剂的筛选,为临床诊断和抗癌治疗提供了一种可行而有力的工具。(2)我们将Maz F介导的N6-甲基腺苷(m6A)检测和poly(A)聚合酶/DSN辅助的信号放大相结合,开发了一种用于FTO单分子检测的荧光生物传感器。m6A是哺乳动物细胞中最普遍的内部修饰。m6A的水平受到RNA去甲基酶,例如FTO和Alk B同源物5(Alk B homolog 5,ALKBH5),和RNA甲基转移酶,如甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)和甲基转移酶样14(methyltransferase-like 14,METTL14)的动态调节。FTO表达失衡与癌症和心血管疾病密切相关。因此,FTO的定量分析对生物医学研究和疾病的临床诊断具有重要意义。在FTO的存在下,单链RNA(single-stranded RNA,ss RNA)底物的m6A位被移除,生成去甲基化的单链RNA底物。去甲基化的单Bemcentinib分子量链RNA可被Maz F特异性切割。经磁分离后,用poly(A)聚合酶扩增含有3′-OH端的切割产物,产生较长的poly-A序列。生成的poly-A序列可与含poly-T的信号探针结合形成DNA/RNA双链,诱导DSN介导的信号探针的循环切割,产生增强的Cy5荧光信号。该方法具有较高的灵敏度和特异性。它可以筛选潜在的抑制剂,在单细胞水平上定量测定细胞内FTO水平,准确区分健康人和肺癌患者肺组织中FTO水平,在生物医学研究和药物开发方面具有巨大的潜力。