目的:DNA的二级结构除经典的B-型构型外,还有许多非经典构型,如G-四链体(G-quadruplex,G4)结构、i-motif等。其中G4结构常被认为与端粒调控、DNA复制、基因表达调控相关。鉴定和检测DNA二级结构是解析其结构与功能的前提,特别是活细胞内的DNA高级结构的鉴定和检测对其在创新诊治重大疾病方法和新药物的开发具有重大意义。目前G4结构的鉴定技术主要有生物物理学和生物学两大类型。这两类方法的原理相似,前者通过识别G4的空间结构来识别G4序列,后者是利用G4结构的生物学特性La Selva Biological Station识别G4序列。传统的检测方法依赖于Elexacaftor体内实验剂量大型仪器,耗时长、方法比较繁琐,可见G4结构的常见检测方法仍存在技术瓶颈。基于G4现有的检测方法,创新性地提出一种全新的对G4进行体外筛选的方法,旨在为目前亟待解决的“细胞内G4结构的筛选和鉴定”提供理论依据和实验支持,为细胞内其它类型的非经典DNA二级结构的筛选和鉴定提供全新的研究思路。方法:以经典的G4结构TBA为模型,利用滚环扩增技术中的锁式探针制备两个环形模板。其中一个环形模板包含TBA序列,另一个环形模板包含TBA的互补序列。利用TBaricitinib体内实验剂量4 DNA连接酶将长单链进行环化,再利用核酸外切酶III将其纯化。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征不同浓度的TMPy P4对G4结构的影响。探讨不同浓度TMPy P4对RCA反应体系的影响,同时筛选出适宜的TMPy P4浓度用于G4结构的筛选。由于线性模板和环形模板的刚性结构不同,利用上述筛选出的适宜TMPy P4浓度,对比了三种不同情况下形成的G4结构在筛选过程中存在的差异。第一种为线性模板先与TMPy P4形成结构,再进行环化和纯化;第二种是线性模板与TMPy P4边形成结构边环化,再纯化;第三种是线性模板先环化和纯化得到环形模板后,再与TMPy P4形成结构。利用上述得到的环形模板,加入引物进行滚环扩增,通过酶标仪检测荧光信号,根据信号的有无区分有无G4结构的形成,从而达到筛选G4的目的。结果:1、利用锁式探针构建的环形模板,环化与纯化后可以作为实验的模板。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳表明:当G4与TMPy P4的浓度比例为1:5、1:10、1:20、1:50时,有明显的G4结构形成。3、当G4与TMPy P4的浓度比例1:5、1:10、1:20时,对RCA反应体系的无影响,当G4与TMPy P4的浓度比例1:50时,对RCA反应体系有影响。4、TMPy P4与线性模板孵育后会降低模板的稳定性,降低模板的连接效率;5、TMPy P4会降低T4 DNA连接酶的工作效率;6、线性模板先环化和纯化得到环形模板后,再与TMPy P4形成结构,该种方法更有利于G4结构的筛选;7、先环连接后形成G4结构进行筛选时,环形模板与TMPy P4孵育的最优时间为1 h;8、含G序列与TMPy P4的浓度比例为1:20时,形成的G4可完全阻碍phi 29 DNA聚合酶的移动(P<0.05),实现G4的体外筛选。结论:本研究建立了一种基于滚环扩增技术对G4进行体外筛选的新方法。在本研究中,先环连接后形成G4结构可实现G4的体外筛选;进行筛选时,环形模板与TMPy P4的浓度比例为1:20且在25℃孵育1 h后,形成的G4可完全阻碍phi29 DNA聚合酶的移动,实现G4的体外筛选。