背景与目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是颌面部最常见的恶性肿瘤,化疗是中晚期癌症患者常用的治疗手段,多柔比星(Doxorubicin,Dox)作为蒽环类化疗药物,能有效治疗多种癌症,但由于其具有严重的心脏毒性及肝、肾毒性等,Dox的临床应用受到限制。光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)具有非侵入性及副作用小等优点,广泛用于临床癌症治疗。传统光敏剂存在水溶性差、半衰期短、组织穿透能力弱等问题。因此,本研究利用980nm近红外光激发的上转换纳米颗粒(Up-converting Nanoparticles,UCNP),解决了传统PDT组织穿透性弱的问题。利用红细胞膜仿生系统构建了一种化疗和光动力治疗结合的纳米载药体系,显著延长了药物的体内循环时间,大大降低了 Dox的毒副作用。纳米载体的应用实现了化疗、PDT和肿瘤免疫治疗的联合应用,有效的抑制了肿瘤生长,为口腔鳞癌的治疗提供了新思路。实验方法:1.我们按照一定比例将 DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-ce6、DSPE-PEGCL13900核磁2000-上转换混合通过自组装形成纳米载体,纳米共沉淀法制备纳米粒子Dox/ce6/UCNP。通过低渗渗透法提取红细胞膜,按照一定的比例将红细胞膜和纳米粒子混合,利用挤压法获得红细胞膜伪装的纳米载药体系Dox/ce6/UCNP@R。动态光散射(Dynamic Light Scatterselleck Belnacasaning,DLS)检测粒径大小,透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察纳米载药体系的形态,超微量分光光度计检测各组分药物的UV图谱及药物包载率,稳态/瞬态荧光光谱仪检测UCNP的荧光光谱,蛋白质免疫印迹实验检测纳米载药体系的主要功能膜蛋白变化,使用透析袋检测Dox的体外释放。2.通过CCK-8法检测各组分纳米药物对ca127和scc7两种肿瘤细胞的抑制能力,使用DCFH-DA荧光探针检测活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的释放情况,通过纳米药物与溶酶体的共定位实验检测其内涵体逃逸情况。检测体外钙网蛋白(Calreticulin,CRT)外翻和腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)释放情况验证肿瘤细胞的免疫原性死亡。3.检测一定时间内小鼠血液中Dox和ce6的荧光强度,来验证free Dox+ce6、Dox/ce6/UCNP和Dox/ce6/UCNP@R的体内循环时间,利用scc7构建C3H小鼠单侧肿瘤模型,小动物活体三维成像系统检测2、4、6、8、12、24h时小鼠体内肿瘤组织的荧光图像,处死小鼠后收集肿瘤、心、肝、脾、肺、肾及肌肉组织,拍摄荧光图像,检测纳米药物的体内分布情况,利用scc7构建C3H小鼠双侧肿瘤模型,通过尾静脉注射纳米药物,监测双侧肿瘤体积及小鼠体重变化,第14天时处死小鼠,解剖收集双侧肿瘤组织和主要组织器官,并对原位肿瘤组织进行CRT和高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Protein B1,HMGB1)的免疫荧光染色。实验结果:1.动态光散射法检测Dox/ce6/UCNP@R的粒径在151.3±12.01 nm,Zeta电位为-13.9±1.9mV,透射电镜显示球形的纳米粒子外包裹了一层囊泡,呈现出典型的壳-核结构。超微量分光光度计测得各组分的UV图谱,并将478 nm作为Dox的检测波长,403nm作为ce6的检测波长。计算出我们制备的纳米粒子Dox和ce6的载药率分别为14.8±0.57%和8.3±0.5%。UCNP在980 nm激发下的荧光光谱表明其在645-675 nm处发射出窄的光谱带。蛋白质免疫印迹实验证明红细胞膜包覆纳米粒子后其表面的主要功能膜蛋白CD 47、CD 44基本没有减少,保留了细胞膜表面蛋白的主要功能,也侧面说明了纳米载药体系的成功制备。体外药物释放实验表明纳米载药体系能够长时间的缓慢释放Dox,并且在酸性环境下(PH=4.5)Dox的释放速率和释放总量增加。2.CCK-8实验结果表明各组分药物均能有效的抑制ca127和scc7细胞的增殖,并且呈现出浓度依赖性,而激光治疗组细胞抑制率明显高于非激光治疗组,Dox的浓度越高,差别越明显,表明化疗和光动力治疗联合的抑制肿瘤效果明显优于单纯化疗。ROS荧光结果Fc-mediated protective effects显示激光照射后的Dox/ce6/UCNP@R组绿色荧光明显增强,说明Dox/ce6/UCNP@R展现出良好的光动力治疗效果。内涵体逃逸实验表明Dox/ce6/UCNP@R能够有效的被肿瘤细胞摄取,并从溶酶体中逃逸出来,更好的杀伤肿瘤细胞。激光照射后Dox/ce6/UCNP@R组CRT外翻和ATP释放量的增加,证明了 PDT能够诱导肿瘤细胞发生明显的ICD。3.小鼠体内循环实验发现Dox/ce6/UCNP@R组Dox和ce6的荧光衰减速率明显低于Dox/ce6/UCNP和free Dox+ce6组,表明红细胞膜的包覆显著延长了药物的体内循环时间。体内分布实验发现纳米粒子能有效的聚积到肿瘤组织,减少了在正常组织的无效分布。抑瘤实验证明了 Dox/ce6/UCNP@R(+)能够有效抑制双侧肿瘤的生长,并且对正常组织没有明显的毒副作用。组织免疫荧光染色发现原位肿瘤组织内发生了明显的ICD,远位肿瘤的生长抑制证明了 PDT引发的ICD能够增强体内抗肿瘤免疫反应。结论:综上,我们设计制备的纳米载药体系Dox/ce6/UCNP@R有良好的生物安全性,红细胞膜的包裹延长了体内循环时间,化疗和PDT联合治疗有效的抑制肿瘤生长,并且诱导肿瘤细胞的ICD,调节机体的抗肿瘤免疫反应,为增强肿瘤的免疫治疗提供新思路。