目的:自噬和铁死亡参与调节胰岛β细胞功能障碍,核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)介导自噬,并拮抗铁死亡。课题组前期研究发现葡萄籽原花青素提取物(Grape seed proanthocyanidin extracts,GSPE)通过激活Nrf2通路拮抗糖脂毒性诱导的胰岛β细胞损伤,但其具体机制并未完全阐明。因此本研究旨在探讨糖脂毒性诱导的β细胞损伤中自噬和铁死亡的关联及GSPE可能的保护机制,为T2DM的防治提供依据。方法:选取小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞给予25mmol/L葡萄糖和200μmol/L棕榈酸钠(high Glucose and high Sodium Palmitate,GP)建立胰岛β细胞损伤模型,CCK8法检测0h、6h、12h、24h、48h细胞存活率,Western Blot检测GP干预不同时间(0h、12h、24h、48h)铁死亡关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)及自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein1 light chain3,LC3Ⅱ)和P62表达。用铁死亡诱导剂erastin、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)、自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)和自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)干预MIN6细胞,使用CCK8检测细胞存活率;荧光显微镜观察活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的荧光强度;用相应试剂盒测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,Lillie染色检测细胞内Fe~(2+);使用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化;Western Blot检测GPX4、ACSL4及铁稳态相关蛋白铁蛋白(Ferritin,FE)和核受体辅激活蛋白4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)、自噬相关蛋白LC3Ⅱ和P62表达。不同浓度的GSPE及si-Nrf2后用GSPE干预,用CCK8检测细胞存活率;荧光显微镜观察ROS的荧光强度;用相应试剂盒测定SOD、GSH、MDA含量,Lillie染色检测细胞内Fe~(2+);使用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化;Western Blot检测TamoxifenGPX4、ACSL4、FE、NCOA4、寻找更多LC3Ⅱ和P62,以及Nrf2及其下游蛋白血红素加氧酶1(Heme oxygenase-1,HO-1)的表达。结果:1.铁死亡在高糖高脂诱导的MIN6细胞中的作用:GP及铁死亡激活剂erastin干预使细胞活力显著降低,SOD和GSH含量及线粒体膜电位降低,MDA含量、ROS荧光强度及Fe~(2+)含量上升(P<0.05),使GPX4、NCOA4蛋白下调,ACSL4、FE蛋白上调(P<0.05)。与GP组相比,Fer-1干预使细胞活力显著升高,SOD和GSH含量及线粒体膜电位升高,使MDA含量、ROS荧光强度及Fe~(2+)含量降低(P<0.05),使GPX4及NCOA4蛋白上调,ACSL4及FE蛋白下调(P<0.05)。2.自噬在高糖高脂诱导的MIN6细胞铁死亡中的作用:GP及CQ干预使细胞活力显著降低,SOD活力、GSH含量及线粒体膜电位降低,MDA含量、ROS荧光强度及Fe~(2+)含量上升(P<0.05),使GPX4、NCOA4蛋白下调,ACSL4、FE、LC3Ⅱ及P62蛋白上调(P<0.05)。与GP组相比,自噬激动剂RAPA干预使细胞活力显著升高,SOD和GSH含量及线粒体膜电位升高,MDA含量、ROS荧光强度及Fe~(2+)含量降低(P<0.05),使GPX4、NCOA4及LC3Ⅱ蛋白上调,ACSL4、FE及P62蛋白下调(P<0.05)。3.铁死亡在高糖高脂诱导的MIN6细胞自噬中的作用:与对照组相比,GP干预使LC3Ⅱ及P62蛋白表达上调(P<0.05)。与GP组相比,Fer-1干预使LC3Ⅱ及P62蛋白表达下调(P<0.05),而erastin干预使LC3Ⅱ及P62蛋白表达上调(P<0.05)。4.GSPE对高糖高脂诱导的MIN6细胞中自噬和铁死亡的改善作用:与GP组相比,不同浓度的GSPE干预使细胞存活率升高(P<0.05);SOD和GSH含量及线heart-to-mediastinum ratio粒体膜电位升高;MDA含量、ROS荧光强度及Fe~(2+)含量降低(P<0.05),使GPX4、NCOA4、LC3Ⅱ、Nrf2及HO-1蛋白上调,ACSL4、FE及P62蛋白下调(P<0.05)。5.GSPE通过激活Nrf2通路改善高糖高脂诱导的MIN6细胞自噬和铁死亡:si-Nrf2转染MIN6细胞4h后,GSPE干预细胞24h,与GSPE相比,si-Nrf2后GSPE干预使Nrf2、HO-1、GPX4及NCOA4蛋白下调,ACSL4、LC3Ⅱ蛋白上调(P<0.05)。P62及FE蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GP诱导MIN6细胞发生铁死亡及自噬阻滞,且自噬和铁死亡之间相互促进,导致β细胞损伤。GSPE可能通过激活Nrf2信号通路增强自噬,抑制铁死亡,从而缓解胰岛β细胞损伤。