五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)中富含三萜类成分人参皂苷,包括达玛烷型四环三萜和齐墩果酸型五环三萜。在人参各药用部位中,以达玛烷型皂苷为主,按照C-6位是否连接有羟基,又可分为原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷。本论文考察了原人参三醇型皂苷(Protopanaxatriol-type Saponins,PTS)和其苷元 PPT(Protopanaxatriol,PPT)的抗溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)以及抗脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury,CI/RI)的新生物活性,同时研究了其作用机制及药代动力学。取得了以下创新性成果:一、PTS抗UC的药理作用研究1.PTS中单体皂苷(元)的含量测定采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法测定了 PTS中人参皂苷(元)Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、F1及 PPT 的含量,分别为 19.68%、30.21%、2.87%、8.41%、1.56%、3.28%和 4.15%,总含量占 PTS 的 70.16%。2.PTS对LPS诱导Captisol的RAW264.7巨噬细胞的影响建立了 LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,以细胞上清液中炎症因子释放量为指标,评价了 PTS的抗炎活性。结果显示,PTS(25、50、100 μg/ml)可呈剂量依赖性地降低NO、TNF-α、IL-1β及IL-6含量,说明PTS对炎性损伤具有较好的保护作用。3.PTS对DSS诱导的UC小鼠的影响建立了 DSS诱导的小鼠UC模型,以宏观指标评分、组织病理学、结肠及血清中炎症因子水平为指标,考察了 PTS(25、50、100 mg/kg)对UC小鼠的治疗作用。结果显示,PTS可以显著减缓UC小鼠体重下降、降低疾病活动指数、改善结肠病理损伤、降低炎症因子和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)水平,表明PTS具有良好的抗UC活性。4.PTS抗UC的代谢组学研究采用基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术,检测小鼠血清和结肠中的代谢物变化,探究与PTS抗UC作用密切相关的生物标志物及代谢途径。结果发现,PTS可通过回调木酮糖、核黄素、19-羟色酮等29个生物标志物、及其所涉及的核黄素代谢、花生四烯酸代谢等11条代谢通路途径,而发挥抗UC活性。5.基于网络药理学及分Medical dictionary construction子对接技术探讨PTS抗UC的作用机制采用网络药理学技术构建了“PTS-UC-交集靶点”GSI-IX供应商网络,采用分子对接技术将主要成分与关键靶点进行对接,推断了 PTS抗UC的潜在机制。结果表明,PTS可能通过影响STAT3、PIK3CA、VEGFA、AKT1和FGF2等关键靶点,从而调节 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、PI3K-Akt、VEGF 等信号通路,而发挥抗UC活性。PTS中的7个主要成分与上述5个关键靶点的结合能均小于-6.4 kcal/mol,表明均具有良好的结合作用。二、PTS及PPT抗CI/RI活性及机制的研究1.PTS对CI/RI大鼠的影响采用线栓法建立了大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型,以神经功能缺失评分、脑梗死体积、组织病理学形态、氧化及炎症因子水平为指标,评价了PTS(25、50、100 mg/kg)对CI/RI大鼠的保护作用。结果表明,PTS中、高剂量可以显著降低神经系统损伤、脑梗死体积、减轻神经元损伤、改善细胞形态、提高尼氏小体数量、调节氧化因子含量、减少炎症因子水平。具有抗CI/RI的生物活性。2.PTS中主要成分对OGD/R-PC12细胞的影响采用OGD/R-PC12细胞模型,模拟体外脑缺血再灌注损伤,以细胞存活率、氧化及炎症因子为指标,评价了 Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、F1及PPT(6.25,12.5,25 μM)对OGD/R-PC12细胞的保护作用。结果表明,7种成分可以显著增加细胞存活率、降低MDA、TNF-α和IL-6含量、升高SOD含量。对体外脑缺血再灌注损伤具有较好的保护作用。其中,PPT(12.5 μM)活性最强,优于阳性对照药物尼莫地平。3.PPT对CI/RI大鼠的影响采用线栓法建立了大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型,以神经功能缺失评分、脑梗死体积、血脑屏障完整性、组织病理学形态、氧化及炎症因子水平为指标,评价了 PPT(5、10、20 mg/kg)对CI/RI大鼠的保护作用。结果表明,PPT可以显著降低神经系统损伤和脑水肿、脑梗死体积、修复血脑屏障、减轻神经元损伤、改善细胞形态、提高尼氏小体数量、调节氧化因子含量、减少炎症因子水平。显示出较强的抗CI/RI活性。4.PPT对OGD/R-PC12细胞凋亡、自噬和血管生成相关蛋白的影响建立了 OGD/R-PC12细胞模型,测定了 PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果表明,PPT能显著提高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和Bcl-2/Bax蛋白的表达;降低 cleaved-Caspase 9/Caspase 9、cleaved-Caspase 3/Caspase 3 线粒体凋亡蛋白的表达;促进自噬相关蛋白p-mTOR/mTOR和血管形成相关蛋白HIF-1α的表达;PPT与Akt、HIF-1α、mTOR、PI3K等关键蛋白的分子对接结果表明,结合能均小于-7.0 kcal/mol。综上,PPT可能通过PI3K/Akt通路对OGD/R-PC12细胞凋亡、自噬和血管生成相关蛋白进行调控,而发挥保护细胞损伤作用。5.PPT抗CI/RI的代谢组学研究采用基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术,检测大鼠血清和脑组织中的代谢物变化,探究与PPT治疗CI/RI相关的生物标志物及其代谢途径。结果表明,PPT可通过回调L-苯丙氨酸、2-氨基萘、熊去氧胆酸等19个潜在的生物标志物,共涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等5条代谢通路途径,发挥抗CI/RI的作用。三、灌胃给予大鼠PPT的药代动力学研究建立了测定生物样品中PPT含量的UPLC-MS/MS方法,LLOQ、线性范围、特异性、准确度、精密度、稀释可靠性、提取回收率、基质效应和稳定性等均满足药代动力学研究的要求。测定了灌胃给予大鼠PPT(10、20、40 mg/kg)药-时曲线、组织分布、排泄、代谢。1.血浆药-时曲线PPT在血浆中含量较低,Cmax分别为243.94、391.93、572.55 ng/ml;体内吸收较快,Tmax0.92～1.00 h;消除较缓慢,t1/2 7.31～9.00h,CL 9.07～14.08 L/kg·h-1,MRT(0-t)9.22～9.53 h;血管外分布较高,Vd 95.86～182.46 L/kg。PPT在体内药代动力学属线性过程,且不存在性别差异。2.组织分布灌胃给予大鼠PPT(20 mg/kg)的组织分布研究结果表明,PPT在组织中的药物浓度明显高于血浆药物浓度,给药1.5 h至9 h,在组织中广泛分布。在1.5 h和3h时,PPT主要分布在小肠、肺、心中,且在3h时达到峰值,9 h时,PPT在脑组织中达到峰值。提示其抗脑缺血再灌注损伤与药物在脑中的分布有关。3.排泄灌胃给予大鼠PPT(20 mg/kg),经粪样排泄在4～8 h达到最大排泄速率,经尿样排泄在8～12 h达到最大排泄速率,粪样和尿样在72 h内累积排泄量分别为49.05±2.07%和3.81±0.21%,总累积排泄量为52.86%。粪便累积排泄较高可能与PPT的低水溶性有关。4.代谢PPT在体内存在广泛代谢,从灌胃给予大鼠PPT(20 mg/kg)的血浆、粪样和尿样中共鉴定了 13个代谢物,包括Ⅰ相代谢物3个和Ⅱ相代谢物10个。综上,本论文筛选出PTS及其苷元PPT的新生物活性,初步探讨了其作用机制,并阐明了 PPT体内药代动力学行为,为进一步研究与开发PTS及PPT创新药物提供了科学依据,也为UC及CI/RI提供了天然来源的候选药物。本论文创新点:1.发现了 PTS抗溃疡性结肠炎的药理作用;2.发现了 PTS及PPT抗脑缺血再灌注损伤的药理作用;3.开展了 PPT的药代动力学研究,获得了较系统的药动学参数。