睾丸炎可由细菌和衣原体感染、杀虫剂、环境或草料污染物等多种因素引起,睾丸通常发生肿胀、发热、充血,影响精子发生,可使精子数量减少、活力下降、畸形率增高,严重时出现无精现象,严重影响畜牧业的发展。抗生素目前仍然是治疗睾丸炎的有效药物,但近年来由于抗生素的不合理使用甚至滥用以及新型抗生素研发缓慢等因素,细菌耐药、抗生素残留超标等问题日益突出。因此,临床上迫切需要寻找抗生素替代品用于睾丸炎的防治。抗菌肽虽是目前国际公认最具潜力的抗生素替代品之一,然而目前对其如何防治动物生殖系统炎症仍未见报道。本研究基于临床调查和体内外模型,筛选了针对睾丸炎的抗菌肽——蜂毒肽X(mastoparan X,MPX),进而从细胞、组织、个体及药代等水平,系统地评价了MPX对细菌性睾丸炎的防治效果,为雄性生殖系统炎症治疗药物的研发奠定了基础,具体研究如下:1.牛睾丸炎临床调查、睾丸炎症模型的建立及抑炎抗菌肽的筛选对吉林长春、河南新乡等地牛养殖场睾丸炎流行情况进行初步调查,调查品种包括荷斯坦牛、夏洛莱牛、西门塔尔牛等300余头,睾丸炎阳性率为4%。由于KD025 molecular weight支持细胞(Sertoli cells,SCs)对精子发生有重要作用,为研发牛睾丸炎治疗药物,从30 d犊牛睾丸分离纯化原代SCs,免疫荧光染色证实其可高表达SCs分子标记蛋白WT1。采用不同浓度的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激牛SCs,建立了牛SCs炎症模型,结果显示:终浓度100 ng/m L的LPS能有效诱导牛SCs炎症因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6和IL-8的高表达,增加牛SCs凋亡,降低血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)相关分子N-钙粘蛋白和紧密连接(tight junction,TJ)蛋白Occludin的表达,干扰F-肌动蛋白的正常分布。随后比较了小鼠腹腔、睾丸原位、阴囊内注射LPS建立睾丸炎动物模型的效果,结果表明最佳致炎途径为腹腔注射,致炎剂量为5 mg/kg,监测时间点为Navitoclax核磁注射LPS 24 h后。LPS致炎组表现出典型的睾丸炎病理变化:精子数量减少,活力降低;睾丸氧化应激反应增强;TJ屏障破坏,连接松散,紧密度降低,间隙增宽等。在牛SCs炎症模型的基础上,从16种候选肽中筛选获得能有效降低睾丸炎症性反应的抗菌肽——MPX,细胞有效浓度为2.5μg/m L,本部分数据为后期预防和治疗睾丸炎效果评价奠定基础。2.MPX治疗睾丸炎的BIOCERAMIC resonance作用及其体内药代分布规律MPX通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的活化,尤其是p38和胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的磷酸化,降低LPS诱导的牛SCs分泌IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。MPX还可以有效上调牛SCs中Occludin和Claudin-1等屏障相关蛋白的表达,抑制LPS诱导的氧化应激反应,从而维持BTB的完整性,MPX预处理细胞还能显著降低Bax和Caspase-3的表达,从而抑制牛SCs的凋亡。在小鼠睾丸炎模型上发现,与LPS致炎组相比,腹腔注射MPX(5 mg/kg)治疗组表现出较轻的睾丸炎症性损伤:BTB相关蛋白Claudin-1、ZO-1、Occludin、E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白表达量显著增加;睾丸氧化应激反应降低;附睾中成熟精子的数量和活力显著提升。MPX体内药代分布规律研究发现:1)腹腔注射MPX(2.5mg/kg,FITC-MPX)1 h后,MPX可以进入血液循环,2 h后呈现全身性分布;2)静脉注射MPX 2 min后即可呈现全身性分布,全身荧光信号持续时间超过2 h;3)睾丸原位注射能使MPX滞留睾丸部位达2 h;4)灌胃给药30 min内,MPX主要分布在胃部和胸腔位置,30 min以后呈现出多组织分布,1 h后能在睾丸部位检测到荧光信号;5)MPX主要集中在肠道(以十二指肠和空肠为主),其次为睾丸和肾脏,对心、肝、脾和肺脏亲和性较低;6)MPX通过肾脏代谢并经尿液排出,腹腔和静脉注射组MPX排出量较多,灌胃组MPX排出量较少。考虑到饲喂给药对其未来实际应用较为便利,因此后续实验采用这一方式。3.饲喂MPX预防睾丸炎的效果评价为评价MPX作为饲料添加剂用于睾丸炎的预防效果,以小鼠为模型动物,将MPX(0.5 mg/kg)灌胃给药20 d和40 d后,腹腔注射LPS诱导小鼠急性睾丸炎。结果发现,MPX能有效改善睾丸生理机能,提高雄激素受体(Androgen Receptor,AR)、SRY相关HMG结构域蛋白9(SRY-related HMG box protein 9,SOX 9)和抑制素亚单位βB蛋白(Inhibin subunit beta B,IBP)的表达;提高精子数量和质量,且能有效预防LPS诱导的睾丸炎症性损伤,降低睾丸炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和CCL2)的表达。MPX还可通过上调睾丸Bcl-2、下调Bax和Caspase-3等凋亡相关因子,抑制LPS诱导的生精细胞凋亡。另外,MPX通过Keap1/Nrf2信号通路,上调睾丸中Keap1、GLCM和Nrf2的表达,下调GCLC和i NOS的表达,从而增加睾丸中GSH、T-SOD、CAT的含量和活性,降低NO、MDA的含量,起到调节睾丸氧化应激的作用。此外,MPX还可促进睾丸中Claudin-1、Occludin、ZO-1、N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白的高表达,从而修复LPS所致的BTB损伤。综上,本研究筛选出了针对睾丸炎的抗菌肽MPX,详细评价了其防治睾丸炎的效果,阐明了其药代动力学规律,证实了其在防治睾丸炎、修复BTB、调节睾丸氧化应激等方面具有显著优势,为抗菌肽的临床应用和睾丸炎的防治提供了有益参考。