胍基乙酸(Guanidinoacetate,GAA)是一种天然存在于脊椎动物体内的氨基酸衍生物,具有促进能量代谢、影响神经调节等生理功能,已被广泛用作营养添加剂和医药中间体。目前GAA的工业化生产以化学合成法为主,存在着产物污染、纯化繁锁、对环境不友好等问题。因此开发合成GAA的微生物底盘细胞对于提供一种环保安全、更加高效的GAA生产方法具有重要意BIBW2992采购义。尽管目前实现了以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主生物合成GAA,但是潜在的内毒素污染的风险可能影响其在食品和医药行业的应用。本研究选用食品安全级工业模式微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为宿主,通过GAA异源合成途径的构建与优化、底物降解途径的阻此网站断、鸟氨酸循环的优化,构建以甘氨酸和精氨酸为底物合成GAA的B.subtilis底盘细胞,为其合成提供了一种有效的食品安全级生产方法。主要研究结果和结论如下:(1)构建以精氨酸和甘氨酸为底物的GAA异源合成途径。来自Amycolatopsis kentuckyensis的基因aga T编码L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(Aga T),已被报道在大肠杆菌中催化合成GAA的效果最好。首先将该来源的aga T克隆至表达载体p HT01并转化进宿主B.subtilis 168中,比较4种不同强度的组成型启动子P_(lyt R)、P_(43)、P_(333)、P_biologic enhancement(566)调控Aga T的表达水平。以GFP为报告蛋白,P_(566)调控下的相对荧光强度分别是P_(lyt R)、P_(43)和P_(333)的1.7倍、1.6倍和1.9倍,确定P_(566)调控Aga T表达的转录水平最高。(2)优化Aga T的核糖体结合位点(Ribosome binding site,RBS)和N端编码序列(N-terminal coding sequence,NCS)。设计兼并引物构建RBS和NCS文库,以GFP为报告蛋白通过流式细胞分选术筛选出荧光强度高的突变体。经过全细胞转化验证,本研究第一次在B.subtilis中实现了GAA的合成。接下来将B.subtilis 168替换为BS168-NM6宿主,并优化底物浓度和菌体添加量,GAA产量为0.24 g·L~(-1),进一步提高3.9倍。(3)探究阻断底物的降解途径对GAA合成的影响。分别敲除精氨酸降解途径的基因arg I和甘氨酸降解途径的基因gcv P,结果表明,arg I单敲除菌株合成GAA的效果更好且不影响细胞生长,GAA产量为0.46 g·L~(-1);同时敲除精氨酸降解途径的基因arg I和nos A比同时敲除两种底物降解途径的基因arg I和gcv P效果更好,得到的重组菌B6-2合成GAA的产量为0.91 g·L~(-1)。(4)优化B.subtilis中天然的鸟氨酸循环,促进鸟氨酸回补生成精氨酸,以缓解鸟氨酸对Aga T的抑制作用并增加GAA合成所需的精氨酸。在P_(veg)启动子的调控下,在B6-2基因组上过表达鸟氨酸循环的相关基因,以及car AB、gln A、asp A基因。得到的重组菌B10经过20 h全细胞转化合成GAA的最高产量为4.26 g·L~(-1),最高生产强度为1.58g·L~(-1)·h~(-1),其中底物甘氨酸和精氨酸的摩尔转化率分别为为13.7%和31.7%。