目的本研究利用人肺支气管上皮细胞BEAS-2B,深入探讨TNF-α和IFN-β在呼吸道上皮细胞损伤中的作用和相关分子机制。方法1.单独或联合使用IFN-β,IFN-γ和TNF-α刺激BEAS-2B细胞,模拟促炎细胞因子对人呼吸道上皮细胞的影响。通过检测细胞活力,乳酸脱氢酶的释放,SYTOX Green-DAPI染色等分析IFN-β,IFN-γ和TNF-α单独或联合使用时对呼吸道上皮细胞的细胞毒性作用,同时观察细胞在不同浓度、不同时间的表型变化。2.使用凋亡和坏死性凋亡等通路中关键分子的抑制剂ZVAD-FMK、GSK-872、NSA等,对TNF-α和IFN-β诱导的人肺支气管上皮细胞BEAS-2B的死亡方式进行初步筛选。通过细胞活力检测,乳酸脱氢酶释放检测,SYTOX Green-DAPI染色,Annexin V FITC-PI染色等分析各种抑制剂对TNF-α和IFN-β诱导BEAS-2B细胞死亡的抑制作用。通过Western Blot分析TNF-α和IFN-β刺激人肺支气管上皮细胞BEAS-2B后相关通路关键分子的活化情况。3.利用CRISPR-CAS9技术分别或同时在人肺支气管上皮细胞BEAS-2B中敲低Caspase-8、Caspase-3,并用Western Blot检测BEAS-2B细胞中Caspase-8或/和Caspase-3的表达情况。用TNF-α和IFN-β刺激Caspase-8或/和Caspase-3表达下调的人肺支气管上皮细胞BEAS-2B,通过细胞活力检测,探究敲低Caspase-8或/和Caspase-3对TNF-α和IFN-β诱导人肺支气管上皮细胞BEAS-2B死亡的影响,并通过Western Blot检测相关分子通路的变化情况。结果1.细胞活力检测结果表明单独使用IFN-β,IFN-γ和TNF-α都能在一定程度上抑制人肺支气管上皮细胞BEAS-2B的增殖,其中IFN-β的作用最为显著。用TNF-α、IFN-β和IFN-γ的不同组合来处理BEAS-2B细胞,其中TNF-α/IFN-β的组合显著降低了细胞活力,而TNF-α/IFN-β/IFN-γ与TNF-α/IFN-β相比没有显著差异,表明TNF-α和IFN-β具有协同抑制细胞增殖的作用,并且具有时间依赖性。2.相比对照组,TNF-α和IFN-β联合处理的BEAS-2B细胞死亡形态特征明显,并且SYTOX Green阳性细胞百分比和细胞培养基上清中LDH水平均显著升高。这些结果表明,TNF-α联合IFN-β造成了BEAS-2B细胞死亡。另外,细胞活力检测结果表明,TNF-α和IFN-β联合处理的人支气管上皮细胞16HBE和人肺腺癌细胞H1975的细胞存活率也显著降低。3.细胞活力检测结果表明,Caspase抑制剂ZVAD-FMK和MLKL抑制剂NSA能部分抑制TNF-α/IFN-β诱导的细胞死亡。同时,在TNF-α/IFN-β处理的BEAS-2B细胞中观察到Annexin V-FITC-PI染色呈双阳性。活化的Caspase-3免疫荧光染色和Western Blot结果表明,在IFN-β和TNF-α/IFN-β处理组的细胞中凋亡通路的关键调控分子Caspase-8和CasCeralasertib价格pase-3均被激活,同时PARP1裂解增多,并且具有时间依赖性。此外,与单独使用IFN-β相比,TNF-α和IFN-β的联合使用能更有效地激活Caspase-8和Caspase-3,而ZVAD-FMK能抑制它们的激活。4.细胞活力检测和SYTOX Green-DAPI荧光染色结果表明,当Caspase-8活性被ZVAD-FMK抑制时,NSA能部分抑制TNF-α/IFN-β诱导的细胞死亡。进一步用Western Blot检测发现,虽然IFN-β和TNF-α/IFN-β都增加了MLKL的表达,但没有诱导磷酸化MLKL的产生。进一步检测RIPK3的表达情况,结果显示RIPK3在BEAS-2B细胞中不表达。5.在TNF-α/IFN-β处理的BEAS-2B细胞中观察到细胞膜气球状肿胀,并在培养基上清中检测到IL-1β的释放。另外,使用Caspase-3抑制剂和Caspase-8抑制剂可以部分提高TNF-α/IFN-β处理细胞的存活率,同时减少LDH释放。在BEAS-2B细胞中敲低Caspase-8或/和Caspase-3后,TNF-α/IFN-β诱导的细胞死亡受到抑制,同时焦亡相关分子GSDM3-MethyladenineD和GSDME的活化性裂解减少。结论1.单独使用IFN-β,IFN-γ和TNF-α时对人肺支气管上皮细胞BEAS-2B的增殖都能产生一定的抑制作用,其中IFN-β在低浓度时可以有效的降低细胞存活率,而TNF-α的加入可以增强IFN-β这一作用。TNF-α和IFN-β具有协同损伤人肺支气管上皮细胞BEAS-2B的作用,并具有时间依赖性。此外,TNF-α和IFN-β对肺组织medicine review来源细胞具有普遍损伤作用。2.TNF-α和IFN-β可以有效的协同激活Caspase-8和Caspase-3,产生裂解的PARP1,导致BEAS-2B细胞发生凋亡。虽然TNF-α和IFN-β促进了MLKL的表达,但由于BEAS-2B细胞不表达RIPK3无法诱导坏死性凋亡的发生。3.TNF-α和IFN-β通过激活Caspase-8和Caspase-3并进一步诱导GSDMD和GSDME活化性裂解,最终导致BEAS-2B细胞发生焦亡。抑制Caspase-8和Caspase-3的活性或降低它们的表达可以缓解TNF-α和IFN-β对BEAS-2B细胞的毒性作用。另外,ZVAD-FMK和NSA可以协同抑制TNF-α和IFN-β的细胞毒性作用。