背景和目的骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种累及全身多个关节的退行性疾病,在全世界各类人群中具有较高的患病率和致残率。终末期骨关节炎患者往往需要行关节置换手术以减轻痛苦和恢复生理功能,但关节置换手术往往伴随着诸多并发症和失败率,患者满意度不高。骨关节炎以软骨损伤和软骨退变为重要病理表现。基于软骨组织的特殊性,软骨细胞是唯一能够合成并维持软骨组织形态的细胞,任何对软骨细胞的损伤,都会最终损害软骨组织的功能和完整。最新的研究表明,机械应力负荷在骨关节炎的发生、发展中发挥着重要作用,并被广泛研究。有研究发现,高的机械应力负荷与多种细胞的程序性死亡事件密切相关。铁死亡是新近发现的一种区别于细胞凋亡、坏死、焦亡的细胞程序性死亡方式,以细胞内膜结构的脂质过氧化损伤为特征,主要表现为细胞内ROS含量增多,关键调控蛋白GPX4的活性和表达下降,线粒体皱缩、线粒体膜增厚。Piezo1蛋白(机械敏感性离子通道蛋白1)是被证实存在于人类软骨细胞上的一种离子通道蛋白,通过响应不同形式的机械应力刺激,选择性通透以Ca2+为主的多种离子,最终实现将压力信号转化为电化学信号。基于软骨细胞在骨关节炎发展中的重要地位,以及机械应力,Piezo1蛋白,细胞铁死亡与软骨细胞损伤的潜在联系,因此本研究主要想探讨以下几点问题:(1)高机械应力诱发的骨关节炎中,铁死亡、Piezo1蛋白是否参与其中。(2)软骨细胞铁死亡在骨关节炎的发生、发展中发挥何种作用,调控软骨细胞铁死亡会对骨关节炎产生何种影响。(3)高机械应力激活Piezo1蛋白后,将如何调控软骨细胞的活性,以及机械应力、Piezo1蛋白、软骨细胞铁死亡三者间是否具有某种联系,这种联系是通过何种分子途径实现的。方法(1)收集人类膝关节骨关节炎患者负重区与非负重区软骨组织,进行mRNA转录组测序,以探究高机械应力所引起的蛋白表达差异,同时部分软骨组织送透射电镜观察,明确高机械应力下,软骨细胞是否具有铁死亡的特征性表现。设计并制备体外细胞机械应力刺激培养模型,提取小鼠原代软骨细胞,进行高机械应力刺激,检测铁死亡关键调控蛋白GPX4的表达水平,透射电镜观察软骨细胞线粒体,以明确高机械应力是否能诱发软骨细胞铁死亡。(2)构建铁死亡调控蛋白GPX4软骨细胞特异性敲除小鼠(Col2a1-CreERT GPX4flox/flox),通过特异性敲除软骨细胞上GPX4的表达并诱导骨关节炎,行Micro-CT,番红固绿染色,免疫组化染色等检测方法,来验证软骨细胞铁死亡对于骨关节炎进展的影响。另一方面,通过过表达铁死亡旁路调节途径的调控蛋白FSP1(铁死亡抑制蛋白1)和补充调控因子辅酶Q10,来抑制因GPX4敲除而诱发的软骨细胞铁死亡,探讨软骨细胞铁死亡在骨关节炎发生发展中的作用。(3)提取野生型小鼠原代软骨细胞,给予体外机械应力刺激,同时加入Piezo1蛋白抑制剂(GsMTx4),检测细胞内钙离子含量变化情况,细胞活性,细胞内还原型谷胱甘肽GSH水平,线粒体形态、活性和膜电位以及GPX4、代谢相关指标的表达情况,明确Piezo1蛋白是否参与高机械应力诱发的软骨细胞铁死亡,及其具体发挥的作用。其次,利用野生型小鼠建立DMM骨关节炎模型,通过关节腔内注射GsMTx4,并进行Micro-CT,番红固绿染色,免疫组化染色等检测方法,明确Piezo1蛋白在骨关节炎进展中发挥的作用。提取GPX4软骨细胞特异性敲除小鼠(Col2a1-CreERT GPX4flox/flox)的原代软骨细胞,添加4-OH-TAM行体外软骨细胞GPX4敲低,然后行体外机械应力刺激培养,观察细胞内钙离子含量变化情况,细胞活性,细胞内还原型谷胱甘肽GSH水平,线粒体形态、活性和膜电位以及GPX4、代谢相关指标的表达情况,明确GPX4介导的软骨细胞铁死亡是否是高机械应力激活Piezo1蛋白后的关键下游通路。最后,我们移除细胞外的钙离子,再次进行体外机械应力刺激培养,观察细胞内钙离子含量变化情况,细胞活性,细胞内还原型谷胱甘肽GSH水平,线粒体形态、活性和膜电位以及GPX4、代谢相关指标的表达情况,以探讨Piezo 1介导的钙离子内流是否是高机械应力激活Piezo1蛋白与GPX4蛋白介导的软骨细胞铁死亡之间的关键因子。结果(1)高机械应力可降低GPX4蛋白的表达水平,同时诱导软骨细胞线粒体膜增厚、线粒体皱缩。骨关节炎患者负重区与非负重区软骨组织转录组基因测序结果显示,相较于非负重区软骨组织,负重区软骨组织中铁死亡生物标记物GPX4的水平显著降低(P<0.01),同时,软骨组织透射电镜结果显示,负重区软骨细胞表现出了铁死亡的特征,包括线粒体膜增厚、线粒体皱缩和线粒体嵴消失。进一步,体外高机械应力(1MPa,1HZ)刺激软骨细胞,可显著降低GPX4的表达和转录水平(P<0.01)。软骨细胞的透射电镜分析显示,接受高机械应力刺激后,软骨细胞内线粒体表现出铁死亡的特征性表型。收集正常软骨细胞与接受高机械应力后的软骨细胞,mRNA转录组分析显示,GPX4水平显著降低(P<0.01)。在小鼠骨关节中,GPX4蛋白主要定位与软骨浅表层,同时,建立小鼠膝关节DMM骨关节炎模型后,小鼠膝关节软骨表层中GPX4的表达水平显著降低。(2)敲除小鼠骨关节软骨细胞中的GPX4蛋白,加剧骨关节炎程度,而针对性的抑制软骨细胞铁死亡能缓解骨关节软骨的损伤。在小鼠关节膝关节中,GPX4蛋白主要定位于表层软骨细胞,通过构建GPX4软骨细胞特异性敲除小鼠(Col2a1-CreERT GPX4flox/flox)发现,GExposome biologyPX4的缺失,可以加重骨关节炎的程度,同时软骨细胞的合成代谢产物降低,基质蛋白酶表达增多。进一步,向GPX4软骨细胞特异性敲除小鼠关节腔内转染FSP1过表达腺相关病毒以增强FSP1的表达水平,结果表明FSP1的过表达,缓解了因GPX4缺失而加重的骨关节炎程度。FSP1在铁死亡代谢中以辅酶Q10为关键底物,因此我们通过口服辅酶Q10的方法,来研究其对因GPX4缺失而加重的骨关节炎的治疗价值。结果表明,通过口服辅酶Q10能够有效缓解因GPX4缺失而加重的骨关节炎程度。(3)高机械应力通过激活Piezo1蛋白介导的钙离子内流诱发软骨细胞铁死亡。在之前的实验中,我们发现机械应力除了造成GPX4蛋白的表达差异,同时也会造成Piezo1蛋白的差异性表达,具体为在高机械应力组中,Piezo1蛋白的转录水平升高。在小鼠软骨细胞中,予以高机械应力刺激,并添加Piezo1蛋白抑制剂(GsMTx4),结果表明:相较于高机械应力组,抑制Piezo1蛋白后,细胞内钙离子含量降低,细胞内GSH水平升高,GPX4蛋白表达升高,细胞内ROS含量降低,线粒体活性和膜电位升高,细胞损伤减轻。此外,在小鼠骨关节炎模型中,关节腔内注射Piezo1蛋白抑制剂(GsMTx4)能够升高小鼠骨关节软骨细胞中GPX4蛋白水平,减轻关节软骨的破坏程度。进一步,我们提取了 GPX4软骨细胞特异性敲除小鼠(Col2a1-CreERT GPX4flox/flox)的原代软骨细胞,并体外敲低GPX4的表达,然后予以高机械应力刺激和Piezo1蛋白抑制剂(GsMTx4),结果显示:GPX4敲低后,高机械应力刺激仍能诱导细胞内钙离子增多,GSH水平降低,加入GsMTx4后,能够抑制钙离子的水平和恢复GSH的含量。但GPX4敲低后,同样引起了大量软骨细胞失活,予以高机械应力刺激,或者加入GsMTx4,软骨细胞活性不会出现显著性的改变。同样,线粒体膜电位和线粒体活性均在GPX4敲低后出现低表达,机械应力刺激不会再诱发相应改变。最后,为了证明钙离子内流在机械应力诱导的软骨细胞铁死亡中的关键作用,我们制备了无钙离子培养基,并在软骨细胞接受机械应力刺激时和刺激结束后24小时内均采用无钙培养基培养。结果显示:移除细胞外钙离子后,高机械应力刺激无法再降低GSH水平,细胞内ROS含量明显下降,且线粒体活性增强,膜电位升高,GPX4表达水平升高,Col2水平升高,基质蛋白酶ADAMTS5和MMP-13表达水平明显降低,软骨细胞活性明显升高。结论1、高机械应力负荷可诱发软骨细胞铁死亡。2、条件敲除软骨细胞内GPX4的表达,可加重小鼠骨关节炎程度,加剧软骨细胞分解代谢,抑制合成代谢。3、条件敲除软骨细胞内GPX4的表达后,可通过过表达FSP1或补充辅酶Q10以强化铁死亡旁路途径,减轻骨关节炎软骨损伤程度,表明软骨细胞铁死亡会促进OA的进展。4、离子通道蛋白Piezo1参与高机械应力诱导的软骨细胞铁死亡。5、抑制Piezo1蛋白的活性此网站可减轻骨关节炎软骨损伤程度。6、高机械应力诱导的软骨细胞铁死亡是通过PiezSTING抑制剂o1介导的钙离子内流实现的。