宿主防御肽(抗菌肽)是生物体产生的一种小分子多肽,通过直接杀死病原体或调节宿主免疫反应来控制感染。宿主防御肽主要分为两个家族,即cathelicidin家族和defensin家族。鸡源抗菌肽cathelicidin-2(CATH-2)是cathelicidin家族抗菌肽,具有广谱的抗菌活性和免疫调节活性。先天免疫是宿主抵御病原微生物感染的第一道防线,依靠于细胞表面和细胞质中的模式识别受体。NLRP3蛋白是位于胞质的模式识别受体,识别病原体和应激因素,通过形成炎症小体来调节细胞因子IL-1β分泌。研究表明,CATH-2具有调节炎性反应的能力,而NLRP3炎症小体的活化是炎症发生的关键,但是CATH-2调控NLRP3炎症小体活化的机制尚不清楚。本实验以脂多糖(LPS)刺激小鼠腹腔巨噬细胞为刺激模型,首先探究CATH-2调控NLRP3炎症小体的作用,然后通过研究钾离子外流、NEK7和溶酶体渗漏阐明CATH-2诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的机制。1.CATH-2在NLRP3炎症小体激活中的作用为了探究CATH-2是否作用于NLRP3炎症小体,本章采用LPS刺激WT和NLRP3炎症小体相关组分敲除小鼠(NLRP3~(-/-)、caspase-1~(-/-)、ASC~(-/-))腹腔巨噬细胞,然后加入CATH-2处理细胞,通过ELISA、Western blot和q PCR检测相关蛋白表达情况。结果显示,在CATH-2处理下,脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞产生了IL-1β和IL-1α,说明CATH-2作用于IL-1β信号通路。另外,在LPS刺激的NLRP3~(-/-)、ASC~(-/-)、和caspase-1~(-/-)巨噬细胞中,CATH-2诱导的IL-1β分泌显著下降,表明CATH-2通过NLRP3炎症小体通路诱导IL-1β分泌。而且,加入CATH-2后,能够检测到caspase-1和IL-1β活性形式及ASC寡聚化,说明CATH-2可以活化caspase-1及诱导ASC寡聚化从而使IL-1β分泌。有趣的是,加入CATH-2后,NLRP3和IL-1βm RNA无明显变化,说明CAT购买AM-2282H-2不影响第一信号通路。综上所述,这些结果说明CATH-2作为第二信号激活NLRP3炎症小体,导致ASC的寡聚化和caspMedical errorase-1活化,从而促进IL-1β成熟与分泌。2.钾离子外流在CATH-2诱导NLRP3炎症小体激活中的作用研究表明,NLRP3炎症小体激活需要第二信号,包括ATP、线粒体氧化DNA的释放、钾离子外流等。其中,钾离子外流作为NLRP3炎症小体激活过程中的上游事件,受到广泛研究。然而,CATH-2是否通过钾离子外流来激活NLRP3炎症小体还不清楚。为了探究CATH-2是否引起钾离子外流,本章使用KCl溶液抑制钾离子外流,同时使用ATP受体(P2X7)抑制剂作为对照,通过ELISA和Western blot检测相关蛋白表达。结果显示,LPS+CATH-2组的细胞有较高IL-1β和caspase-1成熟分泌,抑制P2X7受体后,LPS+CATH-2组的细胞仍有较高IL-1β和caspase-1成熟分泌,说明CATH-2不依赖于P2X7诱导NLRP3炎症小体的激活。然而,随着氯化钾浓度提升,LPS+CATH-2组的IL-1β和caspase-1分泌量减少,说明CATH-2通过钾离子外流来诱导NLRP3炎症小体活化,从而促进IL-1β分泌。3.NEK7在CATH-2诱导NLRP3炎症小体激活中的作用NEK7在NLRP3炎症小体激活过程中发挥至关重要的作用,它作用于钾离子外流的下游,并能与NLRP3蛋白相互作用,调控NLRP3蛋白的寡聚化,这对ASC斑点形成和caspase-1激活至关重要。然而,CATH-2是否通过调控NEK7来激活NLRP3炎症小体还不清楚。本章通过基因沉默技术敲低NEK7蛋白表达,探究CATH-2是否通过NEK7来激活NLRP3炎症小体。过ELISA和Western blot检测相关蛋白表达。结果显示,NEK7敲低后,LPS+CATH-2组IDN-6556试剂细胞上清中IL-1β和caspase-1分泌量显著降低,说明CATH-2通过NEK7通路来激活NLRP3炎症小体,从而促进IL-1β分泌。4.溶酶体在CATH-2诱导NLRP3炎症小体激活中的作用自身来源的颗粒物及外源颗粒物被吞噬后,会导致溶酶体破裂并释放组织蛋白酶到细胞质中,以上过程对NLRP3炎症小体激活至关重要。然而,CATH-2激活NLRP3炎症小体是否依赖于溶酶体途径还不清楚。本章对溶酶体进行标记并且使用了组织蛋白酶抑制剂,通过荧光观察溶酶体以研究CATH-2是否通过溶酶体和组织蛋白酶激活NLRP3炎症小体。结果显示,LPS+CATH-2组绿色荧光减弱,绿色斑点减少,说明CATH-2可以引起溶酶体泄漏。此外,抑制了组织蛋白酶B(CTSB)后,IL-1β和caspase-1分泌量完全消失,提示CATH-2通过组织蛋白酶B途径来激活NLRP3炎症小体。类似的,LPS+CATH-2组检测到大量ASC斑点,而加入CTSB抑制剂后,ASC斑点显著减少,说明CATH-2通过CTSB途径来诱导ASC斑点形成。总之,我们的研究表明,CATH-2通过破坏溶酶体来释放CTSB,随后促进ASC斑点形成和caspase-1活化。在本研究中,我们探究了CATH-2调节LPS诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞NLRP3活化的机制。我们的结果表明,CATH-2通过NLRP3通路促进IL-1β的成熟和分泌。我们的研究揭示了CATH-2新的免疫调节作用,并为从宿主角度开发新的治疗性免疫调节策略提供了基础,以对抗抗生素耐药病原体。