目的:穿支皮瓣已经成为修复各种原因造成的口腔颌面部大范围复杂组织缺损的主要手段。在临床实践中所需的皮瓣范围往往超过单一穿支血管所能达到的解剖分布区域,需要制备成包含多个穿支体区的跨区穿支皮瓣。而导致大型跨区穿支皮瓣远端出现部分坏死的最主要因素是皮瓣内部固有的血管结构局限,即choke血管。Choke血管区存在于供给皮肤血供的相邻穿支血管体之间,是相邻血管体的血管末梢形成的网络连接,其有效开放AG-221试剂的程度,是决定大型跨区穿支皮瓣远端能否获得充足血供的最为重要的因素。精准了解跨区穿支皮瓣不同choke区的开放程度及有效的血供支配范围,可以避免由于穿支皮瓣远端血供不足造成的组织坏死而导致的灾难性后果,进而提高移植皮瓣成活率。近年来,有关跨区穿支皮瓣choke血管区的研究主要集中在局部组织形态学的观察和部分细胞因子对choke区微小血管的生成和改建的影响。但对于制备移植后的跨区穿支皮瓣整体有效血供范围进行实时监测,以及从整体水平对不同choke区血管随时间变化而改建的基因转录与调控机制还没有明确认识。本研究通过建立大鼠背部跨区穿支皮瓣动物模型,应用便携式内窥镜、组织学及吲哚菁绿荧光造影等方法,对皮瓣有效供血区域以及choke区血管随时间变化的改建情况进行组织形态学及血流动力学研究;并利用转录组测序技术从整体水平上对不同时间点、不同choke区的基因转录情况和调控规律进行转录组学分析,进而揭示跨区穿支皮瓣制备后,可能参与不同choke区血管改建过程的相关分子生物学机制。研究方法:1、建立跨穿支体区皮瓣动物模型。于大鼠一侧背部保留髂腰动脉,切断并结扎肋间后动脉及胸背动脉,制备以髂腰动脉为血供的跨区穿支皮瓣。髂腰动脉与肋间后动脉相吻合区域为chokeⅠ区,肋间后动脉与胸背动脉相吻合区域为chokeⅡ区。2、利用便携式内窥镜对活体动物模型在不同时间点、不同choke区的血管生成及改建的变化趋势特点进行研究。3、分别在皮瓣制备后的第0、1、3、5天对chokeⅠNavitoclax纯度区和chokeⅡ区组织取材,进行HE染色,研究不同时间点、不同choke区血管生成及改建情况。进行CD34免疫组化染色,研究不同时间点、不同choke区血管管径及内皮细胞增殖变化情况;对不同时间点的chokeⅠ及chokeⅡ区血管密度进行单因素方差分析。4、跨区穿支皮瓣可视化有效血供范围及血流动力学研究。通过对跨区皮瓣动物模型建立后第0、1、3、5天进行颈内静脉插管,注入吲哚菁绿荧光造影,利用近红外手术荧光影像系统,对各组跨区穿支皮瓣有效血供范围动态变化进行可视化评价,对皮瓣在不同时间点的荧光造影显像面积进行重复测量方差分析。5、不同时间点的跨区穿支皮瓣chokeⅡ血管区的转录组学研究。利用Illumina高通量测序技术,对跨区穿支皮瓣制备后的0、1、3、5天,chokeⅡ区组织进行转录组测序,通过数据过滤,基因组映射,获得差异表达基因,并进行GO、KEGG富集分析及蛋白互作网络分析。6、不同时间点的跨区穿支皮瓣chokeⅠ血管区的转录组学研究。利用Illumina高通量测序技术,对跨区穿支皮瓣制备后的0、1、3、5天,chokeⅠ区组织进行转录组测序,通过数据过滤,基因组映射,获得差异表达基因,并进行GO、KEGG富集分析及蛋白互作网络分析。结果:1、成功建立以髂腰动脉为供血穿支的跨区穿支皮瓣动物模型。2、通过便携式内窥镜对活体动物模型不同choke区的血管进行观察,在术后早期chokeⅠ区血管管径出现扩张,而后出现迂曲并改建,与相邻穿支体区血管联通。这种扩张随观察时间延长而增强,同时伴有一定程度的血管生成。而chokeⅡ区在术后早期表现为大量毛细血管生成,随时间推移逐渐增强并相互吻合。ChokeⅠ区以血管扩张为主并伴有血管生成。ChokeⅡ区以血管生成为主。3、组织形态学研究HE染色组织学观察到chokeⅠ区的毛细血管在术后主要表现为血管扩张,随着观察时间的推移,其扩张程度呈上升趋势,并伴有血管生成。ChokeⅡ区的毛细血管在术后主要以出芽或套叠的形式表现为血管生成,随着观察时间的推移,新生血管密度逐渐增加。ChokeⅠ区血管扩张程度高于chokeⅡ区。通过CD34免疫组化染色研究发现,chokeⅠ区增殖的血管内皮细胞主要分布在扩张的血管壁上,血管密度随时间延长而增加。对chokeⅠ区不同时间点的血管密度进行方差分析统计分析,结果显示呈逐渐上升趋势,这种趋势在第1天和第3天之间更为明显。第0天与第1天结果比较P=0.035,第1天与第3天结果比较P<0.001,第3天与第5天结果比较P=0.002;差异都具有统计学意义。ChokeⅡ区血管内皮细胞的增殖主要体现在新生血管以及成管结构,且随观察时间的延长呈上升趋势。对chokeⅡ区血管密度进行方差分析,结果显示:第0天与第1天之间比较P=0.148,差异没有统计学意义。第1天和第3天结果比较P<0.001,第3天和第5天比较结果比较P<0.001,差异均有统计学意义。4、吲哚菁绿荧光造影对血流动力学的可视化研究髂腰动脉穿支血管在皮瓣内的供血方向由垂直皮瓣方向变为沿皮瓣长轴方向,且此种改变在术后第1天就出现,并随着观察时间的推移,沿皮瓣长轴的主要供血血管的数量及管径逐渐增加。皮瓣制备完成的即刻,choke I、chokeⅡ区的亮度均降低,choke I区的显像范围无明显变化,chokeⅡ区亮度及范围减弱程度比choke I区更为显著。第1天时,choke I区的亮度及热度较之前有所增加,chokeⅡ区显像仍微弱且范围较小。第3天时,通过chokeⅠ区的血流荧光显像程度明显增强,已经接近髂腰动脉分布区域;chokeⅡ显像范围增大,显像亮度有所改善,局部出现点片状热区。第5天时,chokeⅡ区亮度及热度基本与髂腰动脉分布区域一致。但chokeⅡ区远端仍不显像。对不同时间点皮瓣显像范围进行重复测量设计的方差分析,皮瓣显像面积百分比随观察时间的延长总体呈逐渐上升的趋势。第0天与第1天比较P=0.023,第1天与第3天比较P=0.001,差异均具有统计学意义。第3天和第5天比较P=1.00,差异无统计学意义。5、不同时间点chokeⅡ区的转录组分析。第1天组与对照组共有3721个差异表达基因,其中上调基因1851个,下调基因1870个;GO富集分析结果主要富集于前30个条目,主要包括:细胞外部分、细胞外间隙、炎症反应、白细胞迁移和趋化、中性粒细胞迁移和趋化、对细胞因子的反应、免疫反应等;KEGG富集分析结果主要集中在前30个通路,主要包括:细胞因子及其受体相互作用、PI3K-AKT、趋化因子、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解、细胞黏附分子(CAMs)、RAP1、JAK-STAT、造血细胞系、ECM受体相互作用、RAS、TNF、谷胱medial cortical pedicle screws甘肽代谢等信号通路。蛋白互作网络分析中Hub基因共84个。第3天组与对照组差异表达基因共有2292个,其中上调基因为1296个,下调基因为996个;GO富集分析结果主要富集于前30个条目,主要包括:细胞增殖及调节、细胞迁移、炎症反应、趋化、免疫反应及调节、血管生成、细胞表面、血管形态发生、血管发育等;KEGG富集分析结果主要集中在前30个通路,主要包括:细胞因子及其受体相互作用、破骨细胞分化、趋化因子、细胞分子黏附、PI3K-AKT、类风湿性关节炎、癌症途径、RAP1、TNF、白细胞经内皮细胞迁移、B细胞受体、RAS、Toll样受体等信号通路;Hub基因共有71个。第5天组与对照组的差异表达基因共有2818个,其中上调基因为1512个,下调基因为1306个;GO富集分析结果主要富集于前30个条目,主要包括:解剖结构发育、免疫反应及调节、生长发育、细胞外基质及间隙、炎症反应、细胞生物过程调节、细胞分化、对细胞因子的反应等;KEGG富集分析结果主要集中在前30个通路,主要包括:细胞黏附分子、细胞因子及其受体相互作用、PI3K-AKT、抗原处理和呈递、趋化因子、破骨细胞分化、造血细胞系、细胞外基质受体相互作用、多种微生物感染、细胞凋亡等信号通路;共有Hub基因73个。三个时间点共有的Hub基因为:Cxcl3、Aplnr、C5ar1、Cxcl9、Cxcl10及Cxcl11。三个时间点共有的差异表达基因为962个;相对表达量均位于前20的共有基因为:Hba-a3、Cxcl6、Ankrd1、Cxcxl3、Il-6及Obp2a。三个时间点显著富集排名前30位的共有GO条目为:细胞对化学刺激的反应、炎症反应、对外界刺激反应、生物过程正向调节及免疫系统过程,所涉及的基因包括:Cxcl3、Cxcl9、Cxcl11、Cxcl10、C5ar1等,共34个。6、不同时间点chokeⅠ区的转录组分析。术后第1天组chokeⅠ区与对照组相比较,共有2002个差异表达基因,其中上调基因1072个,下调基因930个;GO富集分析结果主要富集于前30个条目,主要包括:对脂质的反应、炎症反应、免疫反应、生物过程调节、对细胞因子的反应、细胞因子分泌调节、对含氧化合物的反应、对外部刺激的反应、免疫系统过程、细胞因子产生等;KEGG富集分析结果主要集中在前30个通路,主要包括:NF-κB、细胞因子与细胞因子受体相互作用、TNF、JAK-STAT、补体和凝血级联、RAP1、Toll样受体、Fox O、造血细胞系等通路;共有Hub基因51个。术后第3天组与对照组差异表达基因共有2369个,其中上调基因1173个,下调基因1196个;GO富集分析结果主要富集于前30个条目,主要包括:细胞生物黏附、质膜部分、免疫过程、细胞迁移、炎症反应、细胞增殖和调节等;KEGG富集分析结果主要集中在前30个通路,主要包括:细胞黏附分子、细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体和凝血级联、RAP1、白细胞经内皮细胞迁移、趋化因子、PI3K-AKT、造血细胞系、B细胞受体、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解、cAMP、TNF信号通路等;共有Hub基因71个;术后第5天组与对照组差异表达基因共有1600个,其中上调基因为754个,下调基因为846个;GO富集分析结果主要富集于前30个条目,主要包括:生物过程调控、细胞及生物黏附、多种组织和细胞生长发育、免疫反应、炎症反应、细胞外部分及细胞分化等;KEGG富集分析结果主要集中在前30个通路,主要包括:细胞黏附分子、抗原处理和呈递、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解、细胞因子及其受体相互作用、多种微生物感染、自身免疫性疾病、TNF等信号通路;共有Hub基因73个。三个时间点共有的Hub基因为:Ccl19、Cxcl13、Cxcl10、Cck、Ptgfr。三个时间点共有的差异表达基因为289个;相对表达量均位于前20的共有基因为:Hba-a3、LOC103689996、Cyp2e1、RF00001、Myl2、Rnase12及Chga。三个时间点显著富集排名前30位的共有GO条目为:炎症反应、生物过程正向调节、对外界刺激的反应、免疫系统过程及防御反应,所涉及的基因包括:Ccl19、Cxcl10、Ngfr等,共12个。结论:1、大鼠跨区穿支皮瓣模型中,chokeⅠ区及chokeⅡ区血管病理生理变化不同:chokeⅠ区血管主要表现为扩张,并伴有一定程度的血管生成;chokeⅡ区血管主要表现为血管生成,在第3天已获得了基本的血运重建。2、通过对chokeⅠ区的转录组分析,Cck及Ptfgr可能对chokeⅠ区血管扩张的调节起到重要作用;Ccl19及Cxcl13可能在chokeⅠ区的血管生成起到重要作用;Cxcl10可能对血管生成的调节及血管结构改建重塑方面起到重要作用。3、通过对chokeⅡ区的转录组分析,Cxcl3和Aplnr对跨区穿支皮瓣chokeⅡ区的血管生成与改建可能起到重要的正向调节作用;Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11及C5ar1对跨区穿支皮瓣chokeⅡ区的血管生成与改建可能起到负向调节作用。