研究背景汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)属于布尼亚病毒目汉坦病毒科,是传播范围最广的出血热病毒之一。黑线姬鼠是HTNV主要的自然宿主,其感染病毒仅带毒但不发病,而人感染HTNV则可致肾综合征出血热(Hemorrhagic Infected aneurysmfever with renal syndrome,HFRS)。人主要通过吸入含有病毒的气溶胶,误食被污染的食物/水,或者接触含病毒颗粒的动物毛发/排泄物而被感染。研究表明,HFRS以系统性炎症所致血管渗漏为基本病理特点,其发病与单核/巨噬细胞等固有免疫细胞功能紊乱关系密切。本实验室前期发现,HTNV感染后人、鼠巨噬细胞的活化模式具有显著差异,即HFRS患者巨噬细胞表现为持续性炎性激活(M1),而鼠源巨噬细胞则通过表达Lnc-309等一系列种属特异性长链非编码RNA(Long noncoding RNA,Lnc RNA)抑制M1活化,其具体分子机制尚不清楚。研究目的本研究旨在明确鼠源特异性Lnc-309分子在HTNV感染后负向调控炎性巨噬细胞活化的作用机制,并初步评价该分子对HTNV感染的在体保护效果,为构建新型HFRS临床治疗策略提供潜在靶点。方法与结果1.明确HTNV感染后Lnc-309发挥负向调控炎性巨噬细胞selleck激酶抑制剂活化的作用1.1 Lnc-309的序列分析及表达水平变化本实验室前期基于RNA-seq及si RNA筛选等方法初步确定了鼠源Lnc-309具有抑制TNF-α产生而发挥抗炎的作用。为进一步明确Lnc-309的生物学特征及其与病毒感染的关系,首先,我们利用LGC、UCSC、RNAfold等生信软件对该分子的非编码特性、二级结构等进行了系统分析,结果表明Lnc-309中不含有编码区,序列物种保守性较低且含有与蛋白质结合潜能的口袋样结构。其次,利用实时定量荧光PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测HTNV、仙台病毒(Sendai virus,Se V)和水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)感染的鼠源巨噬细胞中Lnc-309的表达水平。结果表明,HTNV感染可诱导骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)和RAW264.7等鼠源巨噬细胞中Lnc-309表达上调,且Lnc-309表达水平与感染时间呈正相关(0-48 hpi,p<0.001)。再次,在HTNV感染小鼠模型中,利用qRT-PCR检测不同脏器中Lnc-309的表达水平。结果表明,攻毒3天后小鼠心、肝、脾、肺及肾脏中Lnc-309的表达均上调,其中以肝脏最为显著(p<0.0001)。1.2探索巨噬细胞中Lnc-309对HTNV复制的影响利用重组慢病毒分别在BMDMs(鼠源巨噬细胞)和THP-1(PMA诱导分化,人源巨噬细胞)中过表达Lnc-309,在此基础上以MOI=1感染HTNV,借助免疫印迹及qRT-PCR等技术分别在蛋白和核酸层面检测HTNV的复制水平。结果表明,Lnc-309过表达可在24 hpi促进病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)表达(p<0.05)及病毒核酸(S)复制(p<0.01)。1.3明确Lnc-309通过抑制多种炎性因子产生从而负向调控炎性巨噬细胞活化的作用为进一步明确Lnc-309对巨噬细胞功能的影响,利用重组慢病毒分别在BMDMs和THP-1中过表达Lnc-309,在此基础上以MOI=1感染HTNV,借助流式细胞术、酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及qRT-PCR等实验,分别对细胞的抗原提呈及炎症调控等免疫相关功能进行检测。结果表明,过表达Lnc-309可促进CD86和CX3CSmoothened Agonist说明书R1表达,提示Lnc-309可增强细胞的抗原提呈和趋化功能;过表达Lnc-309可抑制TNF-α、IL-6和iNOS等炎性巨噬细胞活化相关分子表达,提示Lnc-309主要发挥负向调控炎性巨噬细胞活化的作用。2.阐明Lnc-309-RIPK3-STAT1轴负向调控炎性巨噬细胞活化的分子机制2.1探索Lnc-309对炎性巨噬细胞活化相关信号通路的影响利用重组慢病毒分别在BMDMs及THP-1中过表达Lnc-309,在此基础上感染HTNV(MOI=1),通过免疫印迹等实验检测炎症相关非受体酪氨酸蛋白激酶-信号传导及转录激活因子(Janus kinase-Signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)、核因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)等信号通路的活化情况。结果表明,过表达Lnc-309可显著抑制介导炎性巨噬细胞活化的关键转录因子STAT1的磷酸化(p-STAT1 ser727),但不影响经典炎症信号通路转录因子p65的磷酸化(p-p65 ser276/ser529)。为进一步明确Lnc-309调控STAT1活化的机制,我们利用RPIseq网站进行了互作分析,预测结果显示Lnc-309与STAT1结合的可能性较低(RF classifier score=0.5);之后,我们在HEK293T中同时过表达STAT1-Flag和Lnc-309,利用anti-Flag抗体进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immune-precipitation,RIP)实验,结果提示,STAT1-Flag并不能富集Lnc-309。上述结果表明,Lnc-309可阻断HTNV感染后STAT1介导的炎性巨噬细胞活化,但该过程并不依赖Lnc-309与STAT1的直接相互作用,具体机制有待进一步探索。2.2 HTNV感染后RIPK3直接结合并阻断STAT1介导的炎性巨噬细胞活化我们前期通过RNA-Seq等结果发现,HTNV感染后坏死性凋亡等死亡相关信号通路显著活化,但既往和我们的研究都提示HTNV感染并不引起细胞病变效应,提示死亡相关分子可能发挥非经典的生物学效应。利用qRT-PCR和免疫印迹等实验,我们对HTNV感染后坏死性凋亡相关分子的表达进行了检测,结果表明RIPK3升高最为明显,且其总蛋白表达量与STAT1的磷酸化水平呈负相关。为探索HTNV感染后RIPK3是否调控STAT1信号通路,我们从RIPK3~(-/-)小鼠中分离得到BMDMs,在此基础上感染HTNV(MOI=1)。结果显示,与野生型(WT)相比,RIPK3~(-/-)巨噬细胞中磷酸化STAT1表达增加(24/48 hpi);同时,我们还发现过表达RIPK3可以阻断HTNV感染24/48 hpi后STAT1磷酸化。上述结果表明,RIPK3可通过阻断STAT1信号来抑制炎性巨噬细胞活化。为明确RIPK3调控STAT1活化的分子机制,我们利用共聚焦显微镜观察了上述分子的亚细胞定位情况。结果表明,在HTNV自然感染过程中,RIPK3与STAT1存在共定位且呈点状聚集,并可见部分STAT1入核;在外源过表达体系中,过表达RIPK3可显著抑制HTNV感染后STAT1入核;进一步通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验证实,RIPK3与STAT1存在互作关系,且HTNV感染后两者互作增加。上述结果表明,HTNV感染后RIPK3可直接结合并抑制STAT1磷酸化。2.3 Lnc-309可直接结合RIPK3并增加其与STAT1互作而发挥抑炎作用利用RPIseq等生信分析手段,我们发现Lnc-309可与RIPK3结合(RF classifier score=0.65);在HEK293T中同时过表达RIPK3-Flag和Lnc-309,利用anti-Flag抗体进行RIP实验,结果表明,RIPK3-Flag可以显著富集Lnc-309,提示Lnc-309与RIPK3之间存在相互作用。为明确Lnc-309是否可调控RIPK3的功能,我们在过表达Lnc-309的条件下,利用Co-IP等实验检测了RIPK3与STAT1的互作关系,结果表明,过表达Lnc-309可促进RIPK3结合STAT1。考虑到Lnc-309不能结合STAT1,我们推测,Lnc-309可能通过结合RIPK3,促进RIPK3与STAT1互作,抑制STAT1入核,最终负向调控炎性巨噬细胞的活化。3.Lnc-309的动物保护效果评价为了研究Lnc-309在体内的保护效果,首先,我们基于RNA递送系统构建了可在真核细胞中过表达Lnc-309的质粒(pc DNA6.0-CMV-309),并在HEK293T细胞中进行过表达验证,体外测序结果证实pc DNA6.0-CMV-309质粒序列正确,HEK293T中转染该质粒可过表达鼠源特异性Lnc-309。其次,在裸鼠攻毒后,每48 h通过尾静脉注射100μg质粒(对照组注射空载体,实验组注射过表达质粒),利用qRT-PCR检测各脏器过表达效果。结果表明,与对照组相比,实验组裸鼠肝、肺、肾等脏器Lnc-309表达升高,提示体内过表达成功。再次,监测小鼠体温、体重等整体指标变化,评估Lnc-309过表达质粒对HTNV攻毒裸鼠的整体疗效。结果表明,与对照组相比,实验组裸鼠的体温和体重无统计学差异,但实验组生存时间显著延长(p<0.05)。最后,体内保护实验中,通过HE染色、qRT-PCR等方法分析各脏器的免疫炎症损害情况,明确过表达Lnc-309发挥保护作用的机制。结果表明,实验组裸鼠肺脏中HTNV-S等病毒相关指标升高,但TNF-α和IL-6等炎性细胞因子的表达显著降低;同时,抑炎因子IL-10表达上调;HE染色结果显示,在21 dpi,实验组小鼠肺脏炎性细胞浸润和病理损伤程度较对照组显著改善。上述研究结果表明,Lnc-309通过抑制HTNV感染所致的炎性病理损伤而发挥保护作用。结论HTNV感染鼠巨噬细胞可诱导鼠源特异性Lnc-309表达上调,Lnc-309结合RIPK3并促进其与STAT1互作,从而阻断STAT1介导的炎性巨噬细胞活化,在HTNV感染过程中发挥重要的抗炎保护作用。