苹果酸是苹果果实中主要的有机酸,直接影响果实的风味和营养品质。苹果酸受到环境和农艺措施等多种因素的影响。植物trophectoderm biopsy通过苹果酸和其他代谢物的积累适应低温和盐胁迫,导致果实酸度水平的增加。干旱胁迫对果实酸度的影响已经被广泛研究,然而在干旱胁迫条件下,对干旱应答相关转录因子是什么及如何调节代谢和转运基因影响苹果酸积累的分子机制并没有进行深入的探索。本研究选取18棵长势一致、树龄6年生的‘烟富3号/M26’分别进行(1)正常水分灌溉处理(CK),土壤相对含水量(RWC):55%～70%;(2)过度水分亏缺处理(DRT),RWC:30%～40%;(3)过度水分灌溉处理(WAT),RWC:75%～80%。除遭受长期干旱的DRT处理,其余的灌溉处理采用滴灌系统。在盛花后85、100、115、130、145、160和175天的7个发育阶段进行采样,分别为S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7,每个处理采样12个果实。S4、S6和S7时期的果实样本用作转录组测序,根据分析结果挑选响应干旱胁迫并能调控苹果酸含量的MdMYB70转录因子,解析MdMYB70转录因子应答干旱胁迫调控苹果酸积累的分子机理。主要结果如下:1.DRT处理降低果实的单果重、增加果实的硬度和苹果酸含量。果实盛花后100天,DRT处理的果实单果重明显低于CK和WAT处理的果实单果重。在果实生长发育过程中,果实硬度逐渐降低,但与CK和WAT处理相比,DRT处理的果实硬度更大。盛花后85～130天,各处理间果实含水量无显著差异,但盛花后160天,DRT处理的果实含水量显著低于CK和WAT处理的果实含水量。盛花后130天(S4)、160天(S6),和175天(S7)DRT处理的果实苹果酸含量显著高于CK和WAT处理的果实苹果酸含量,因此选取这三个时期的RNA样本用于转录组测序分析。2.通过分析转录组数据筛选MdMYB70转录因子进行后续的功能验证。为了鉴定干旱处理条件下与苹果酸合成代谢相关的差异表达基因(DEGs),分析参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、生长素信号通路和乙醛酸、二羧酸和丙酮酸代谢途径的DEGs。将DEGs进行整理和分类后分别www.selleck.cn/products/Bortezomib在Swissprot、KOG、KEGG、或GO数据库中进一步鉴定,基于生物功能和生理特征最终总共获得122个差异基因。从中挑选25个干旱条件下与苹果酸积累相关的DEGs进行RTBelumosudil-q PCR表达水平检测。并筛选转录因子MdMYB70作为应答干旱胁迫调控苹果酸含量的候选基因。3.MdMYB70转录因子定位于2号染色体上,由942 bp的开放阅读框(ORF)组成,编码313个氨基酸。MdMYB70作为一个典型的R2R3-MYB转录因子,包含R2和R3 MYB重复结构域。亚细胞定位结果显示GFP标记的MdMYB70蛋白只定位于细胞核中。经过干旱处理后,过表达MdMYB70转录因子的苹果愈伤组织中苹果酸含量显著高于野生型,而CRI-MdMYB70突变体愈伤组织中的苹果酸含量低于野生型愈伤组织。同时,过表达MdMYB70转录因子的苹果愈伤组织在干旱胁迫下的抗氧化能力显著提高。通过构建病毒诱导的基因沉默载体MdMYB70-TRV和过表达载体MdMYB70-OE,将其注射到苹果果实中瞬时表达。结果表明MdMYB70转录因子的过表达提高了苹果果实中苹果酸的含量,MdMYB70转录因子的沉默相对于只注射TRV空载体的苹果果实,苹果酸含量显著降低。MdMYB70在番茄果实中进行异源表达,在自然干旱胁迫处理下,MdMYB70过表达的番茄果实中苹果酸含量显著高于对照番茄。以上结果表明MdMYB70转录因子应答干旱胁迫促进苹果酸的积累。4.MdMYB70与蛋白MdMYB44发生互作且能调控下游靶基因的活性。MdMYB70转录因子过表达愈伤组织中,与苹果酸合成相关基因Md ALMT9的表达水平发生显著变化,酵母单杂(Y1H)试验表明MdMYB70可以结合下游Md ALMT9启动子序列。双荧光素酶试验(LUC)验证MdMYB70对Md ALMT9具有转录激活作用。此外,LUC试验表明MdMYB44通过与MdMYB70互作抑制Md ALMT9的转录活性。在4%PEG干旱处理下,共转化MdMYB44和MdMYB70愈伤组织的苹果酸含量低于MdMYB70转基因愈伤组织。以上结果表明在干旱条件下,MdMYB44抑制MdMYB70对Md ALMT9的转录活性降低苹果酸含量。综上所述,根据苹果酸含量的差异选择S4、S6和S7阶段样本进行转录组测序及分析,挑选MdMYB70转录因子作为应答干旱胁迫调控苹果酸含量的候选基因。通过异源表达‘Micro Tom’番茄、过表达和基因敲除愈伤组织及苹果果实的瞬时表达验证MdMYB70转录因子在干旱胁迫下对苹果酸的调控功能。此外,筛选出与MdMYB70发生互作的蛋白MdMYB44,发现MdMYB44抑制MdMYB70对下游靶基因Md ALMT9的转录激活进而影响苹果酸的含量。