目的:异槲皮苷(isoquercitrin,IQ)为黄酮醇类化合物,其药理活性广泛,如抗氧化,抗动脉粥样硬化等。目前对于IQ的研究大多局限在黄酮有效部位上,对单体的活性与机制研究不够深入。本研究旨在利用H9c2大鼠心肌细胞进行IQ的体外抗氧化活性研究,并结合心肌损伤的斑马鱼和小鼠模型进一步评价其心肌保护作用,基于液质联用技术,应用蛋白组学方法,筛选IQ心肌保Emricasan价格护作用关键蛋白靶点,为IQ在氧化应激引起的心肌损伤等心脏疾病领域的应用提供理论依据。方法:1.IQ体外心肌保护活性研究:利用AAPH诱导H9c2大鼠心肌细胞氧化应激,MTT法考察IQ对细胞活力的影响,DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平,凋亡染色及流式凋亡分析检测细胞凋亡情况,Western blot检测蛋白表达情况。2.IQ对斑马鱼心肌保护作用研究:利用AAPH诱导斑马鱼心肌损伤,荧光探针法考察IQ对斑马鱼体内ROS水平、脂质过氧化水平和凋亡细胞水平的影响,利用心脏特异性荧光标记转基因斑马鱼观察心脏早期发育情况、静脉窦与动脉球距离,利用ELISA试剂盒检测成鱼心肌损伤标志物。3.IQ对小鼠心肌保护作用的验证和机制研究:利用阿霉素诱导小鼠心肌损伤,考察IQ干预后小鼠体重、心电图、心脏指数,HE染色观察心肌组织病理学变化,Western blot和免疫荧光检测蛋白表达及蛋白细胞定位情况。4.基于TMT标记定量蛋白组学技术筛选IQ心肌保护作用关键靶点:利用UPLCOrbitrap Exploris MS/MS技术,建立蛋白样品分析方法,正离子模式得到肽段谱图信息,依据样本来源建立数据库进行蛋白信息鉴定,通过GO富集、KEGG功能富集、蛋白互作等方法筛选关键蛋白靶点。结果:1.IQ体外心肌保护活性研究:IQ提高了AAPH诱导的H9c2细胞存活率,降低细胞内ROS水平,减少凋亡细胞比例,抑制细胞由早期凋亡向晚期凋亡发展,调控Keap1-Nrf2-ARE抗氧化应激通路和线粒体介导的Caspase凋亡通路。2.IQ对斑马鱼心肌保护作用研究:IQ降低了72hpf幼鱼体内ROS、脂质过氧化和细胞凋亡水平,降低72hpf幼鱼心率,缩短静脉窦与动脉球距离,降低成鱼心肌肌酸激酶MB同工酶和心肌肌钙蛋白-I水平。3.IQ对小鼠心肌保护作用的验证和机制研究:IQ改善了心肌损伤小鼠心电异常情况,恢复心电图损伤性ST段抬高波形,缩短PR间期和QT间期时PF-02341066小鼠长,增大QRS波群电压,降低心脏指数,改善心肌细胞完整性及排列情况,减少心肌细胞炎症浸润情况,调控Keap1-Nrf2-ARE抗氧化应激通路和线粒体介导的Caspase凋亡通路。4.基于TMT标记蛋白组学技术的IQ心肌保护作用关键靶点研究:GO富集结果显示,在生物学过程上IQ上调了心肌细胞的生长、形态发生、趋化性以及磷脂代谢等过程,下调了心肌细genetic rewiring胞过度分裂过程;在细胞组分上IQ上调了中心体和纺锤体极;在分子功能上IQ促进了磷脂酰肌醇磷酸激酶活性。KEGG富集结果显示IQ下调了流体切应力与动脉粥样硬化等过程。蛋白互作分析结果显示IQ上调了微粒体谷胱甘肽s-转移酶3和磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶。在AAPH组与IQ-AAPH组中共同调控的关键差异蛋白中有4种蛋白可能与IQ的心肌保护作用密切相关,分别为:Hmox1、Coll2a1、Tor4a、Ppp6r2。结论:本研究从体外和体内水平验证了IQ具有心肌保护活性,可调节心脏早期发育情况,降低心肌酶含量异常升高,调节心脏电生理,改善心肌病理学损伤,并通过激活Keap1-Nrf2-ARE抗氧化应激通路,抑制线粒体介导的Caspase凋亡通路发挥心肌保护作用。Hmox1、Coll2a1、Tor4a、Ppp6r2蛋白及其对应的基因,可作为IQ发挥心肌保护作用的关键靶点用于后续研究。