背景:结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mvcobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的第二大人类致死性传染病,给人类健康造成严重威胁。Mtb作为胞内致病菌,肺泡巨噬细胞是其主要的宿主细胞和靶细胞,二者的相互作用是结核病发生发展的核心环节。其中,宿主细胞的死亡方式决定了 Mtb是否被清除或免疫逃逸,业已证实,巨噬细胞自噬可有效清除Mtb,但Mtb也可利用多种机制抑制宿主自噬。因此,深入探究Mtb感染诱导巨噬细胞自噬的机制,对于明确Mtb与宿主的相互作用具有重要科学意义。细胞自噬过程十分复杂且受到多种因子调控,其机制尚未完全阐明。近年来研究发现,受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)参与调控细胞自噬,但其是否参与调控Mtb感染诱导巨噬细胞自噬未见报道。本课题组前期研究发现,牛结核分枝杆菌疫苗株(M.bovis Bacillus Calmette-Guerin,BCG)感染促进巨噬细胞中RIPK3表达,初步明确RIPK3促进BCG感染后巨噬细胞自噬,但其对BCG感染诱导巨噬细胞自噬的调控机制尚不明确。基于以上研究背景,我们提出的科学问题是:RIPK3参与调控BCG感染诱导巨噬细胞自噬的哪些关键阶段?通过怎样的分子机制调控巨噬细胞自噬?RIPK3对BCG感染后小鼠肺组织内自噬水平和机体抗感染能力有怎样的调控作用?为了回答上述科学问题,拟开展以下研究:目的与方法:1.为了探究RIPK3对BCG感染诱导小鼠巨噬细胞自噬的调控作用,利用BCG感染C57BL/6J野生型小鼠(WT)和RIPK3基因敲除小鼠(RIPK3-/-)骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),通过Western blot、免疫荧光和流式细胞术等方法检测小鼠BMDMs内自噬不同阶段相关蛋白的表达、观察细胞内自噬体数量及自噬流水平等指标。2.为了进一步探究RIPK3调控BCG感染诱导小鼠巨噬细胞自噬的分子机制,利用免疫沉淀-质谱(IP-MS)技术筛选BCG感染后巨噬细胞内与RIPK3互作的自噬相关蛋白,采用免疫共沉淀(CO-IP)和免疫荧光技术在内源和外源水平进行互作验证;确定其存在相互作用关系后,进一步构建RIPK3突变质粒,明确RIPK3与互作蛋白的互作结构域;结合文献调研,明确RIPK3互作蛋白调控自噬的直接相关因子,从内源和外源水平验证RIPK3、RIPK3互作蛋白及其下游自噬相关因子三者的作用关系。3.为了在体内水平探究RIPK3对BCG感染后小鼠肺组织自噬和机体抗感染能力的调控作用,采用气道灌注BCG的方式感染WT小鼠和RIPK3-/-小鼠,通过Western blot和免疫组化等方法检测小鼠肺组织内自噬相关蛋白的表达,并观察肺组织内自噬体及自噬溶酶体数量;利用HE染色、CFU菌落计数、ELISA和流式细胞术等方法检测小鼠肺组织损伤、肺组织内菌载量、小鼠血清中炎性因子表达以及小鼠肺组织内免疫细胞募集的情况。结果:1.BCG感染促进小鼠BMDMs内RIPK3和LC3Ⅱ表达,并促进p62降解。且BCG感染后,与WT BMDMs相比,RIPK3-/-BMDMs内自噬体诱导阶段关键蛋白PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平极显著上调(p<0.01);参与自噬体形成的相关蛋白Beclin1、AtgPLX-47205、Atg7、Atg12和LC3Ⅱ表达量显著下调(p<0.05),自噬体数量显著减少(p<0.05);参与自噬体与溶酶体融合过程的Rab7和LAMP2表达量极显著下调(p<0.01RepSox核磁),p62的表达显著上调(p<0.05),LAMP2与LC3的共定位减少;自噬流被阻滞。同时,BCG感染后RIPK3-/-BMDMs的胞内菌载量较WTBMDMs极显著上升,细胞存活率极显著下降(p<0.01)。2.BCG感染后巨噬细胞内有204个蛋白可能与RIPK3发生相互作用,Medicaid claims data从中筛选出3个直接参与细胞自噬的蛋白,包括Hspa8、ANXA2和Etf1;进一步验证发现RIPK3与膜联蛋白A2(ANXA2)发生相互作用;且RIPK3存在RHIM结构域时,RIPK3与ANXA2发生相互作用。BCG感染后,敲除RIPK3可抑制ANXA2在细胞膜和细胞质的表达,增加其在细胞核的表达(p<0.01),并增强ANXA2和转录因子EB(TFEB)的相互作用,减少TFEB入核;在293T细胞中同时表达RIPK3-HA、ANXA2-Flag和TFEB-Myc质粒,RIPK3促进ANXA2在细胞膜和细胞质表达,抑制ANXA2与TFEB的相互作用,并促进TFEB入核。3.BCG感染促进小鼠肺组织内RIPK3和LC3I1的表达,抑制p62表达。且BCG感染后,与WT小鼠相比,RIPK3-/-小鼠肺组织内LC3II、Beclin1、Atg5和Atg12的表达量显著下调(p<0.05),p62的表达量显著上调(p<0.05),肺组织内自噬溶酶体数量极显著减少(p<0.01)。此外,RIPK3-/-小鼠的肺组织损伤相对较重,肺组织内菌载量极显著升高(p<0.01),小鼠体重在前10天有下降趋势,小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量显著升高(p<0.05),IL-10的表达量显著降低(p<0.05),肺组织内巨噬细胞的数量增多,而CD8+T细胞减少(p<0.01)。结论:1.RIPK3促进BCG感染后小鼠BMDMs内自噬体诱导、自噬体形成以及自噬体与溶酶体融合过程,促进细胞内自噬流水平,同时抑制小鼠BMDMs内菌载量,促进细胞存活。2.RIPK3通过RHIM结构域与ANXA2发生相互作用,促进ANXA2膜易位表达,并抑制ANXA2与TFEB的相互作用,将TFEB从胞质中释放进入细胞核,进而促进BCG感染后小鼠BMDMs自噬。3.RIPK3促进BCG感染后小鼠肺组织内自噬水平,并抑制小鼠肺组织内菌载量,减轻小鼠肺组织炎性损伤,对小鼠抗BCG感染具有保护作用。