无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),又称B族链球菌(Group B streptococcus,GBS)PCI-32765 NMR,是亚洲地区最常见的罗非鱼病原体,严重制约罗非鱼养殖业发展。寻找到合适的罗非鱼无乳链球菌免疫Water solubility and biocompatibility原性蛋白,对于研发预防罗非鱼无乳链球菌病的疫苗,以及快速诊断该病病原具有重要的意义。本研究基于国内外对无乳链球菌病具有高保护性的无乳链球菌外表面蛋白的研究,对gap基因进行生物信息学分析selleck NMR,克隆并表达了gap蛋白,并制备成亚单位疫苗免疫罗非鱼,评估对无乳链球菌病的保护效果;同时,制备gap多克隆抗体,与抗无乳链球菌鼠源单克隆抗体4C12建立一种用于检测罗非鱼无乳链球菌病原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)方法。主要研究结果如下:1.生物信息学分析结果显示,gap基因共编码336个氨基酸,理论分子量约为36 k D,产物是一种不具有跨膜区域和信号肽的稳定的亲水性蛋白。使用PCR克隆得到了1011 bp的gap基因,成功构建了p ET-28a-gap原核表达载体。gap蛋白是一种可溶性蛋白质,其最佳诱导表达条件为23℃条件下添加0.8 m M的IPTG诱导12 h,利用Ni柱亲和层析纯化获得了高纯度的重组gap蛋白。2.使用弗氏佐剂与gap蛋白混合制备亚单位疫苗,通过腹腔注射免疫三次罗非鱼后,间接酶联免疫吸附测定(indirect ELISA,i ELISA)检测显示重组蛋白gap能够诱导较高水平的血清抗体Ig M,对无乳链球菌HN016株攻毒后的相对保护率为64.1%。3.应用gap蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备了抗GBS gap兔源多克隆抗体,效价为1:512 000。以本实验室保存的抗GBS鼠源单抗4C12为捕获抗体、纯化的抗GBS gap兔源多抗为检测抗体,以及HRP标记山羊抗兔Ig G抗体作为酶标抗体建立了一种DAS-ELISA方法。该方法对无乳链球菌的检出限为1.95×10~5 CFU/m L,批内与批间变异系数均小于10%,对罗非鱼海豚链球菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌阳性血清均无交叉反应。应用建立的DAS-ELISA方法对242份已知罗非鱼临床样本进行检测,符合率为98.66%。综上,gap蛋白是高效的抗无乳链球菌感染的重组抗原,可作为一种预防罗非鱼无乳链球菌病的候选亚单位疫苗;基于抗GBS gap兔源多抗和抗罗非鱼Ig M鼠源单抗建立的DAS-ELISA方法,对临床病料的检测结果准确率较高,为研发新型诊断试剂奠定了坚实的基础。