目的:二硫键是蛋白质的两个半胱氨酸的硫原子之间形成的翻译后修饰,维持蛋白质结构和功能。二硫键也是抗体类药物质量控制的关键,PF-02341066 IC50对生物类药品开发具有重要意义。二硫键环化了半胱氨酸之间的蛋白质序列,含二硫键的序列区域的诊断碎片离子释放受到阻碍,很难通过质谱技术直接破译蛋白质序列和结构信息。此外,二硫键的低裂解效率导致酶解肽的碎片离子通过二硫键与另一个完整的肽链相连,这种复杂的碎片很少提供二硫键的定位信息,用常规数据库和程序不能很容易地进行分析。所以增强二硫键解离有助于二硫键和蛋白质结构的表征。由于发色团可以增强紫外光解离(UVPD),本研究引入二乙烯基嘧啶(DVP)作为发色团,使二硫键重新桥连,增强二硫键的紫外光解离。方法:1.将奥曲肽和多个蛋白中二硫键通过DVP重新桥连,利用质谱技术考察了DVP连接剂在奥曲肽、溶菌酶、核糖核酸酶A、β-乳球蛋白和胰岛素中的化学反应性。2.利用质谱技术考察了试剂用量与反应时间对DVP修饰产物转化率的影响。3.利用自上而下质谱分析技术,对无修饰和DVP修饰的溶菌酶和核糖核酸酶A进行高能碰撞解离(HCD)和193 nm UVPD MS/MS分析,系统地研究了重桥连二硫键的裂解途径,计算二硫键裂解效率和蛋白序列覆盖率。4.利用自下而上质谱分析技术,对无修饰和DVP修饰的溶菌酶和核糖核酸酶A的酶解肽进行LC-MS/MS分析,匹配每个肽产生的碎片离子,计算每个肽的二硫键裂解效率。结果:1.DVP可以使奥曲肽和蛋白质的二硫键重新桥连。在非变性条件下,溶剂可及性高和与DVP反应时空间位阻小的二硫键容易被DVP修饰;在变性条件下,蛋白质中几乎所IACS-010759体内有的链内二硫键都可以被修饰。2.奥曲肽和蛋白与DVP反应2 h后,产物转化率趋于稳定。3.试剂用量增加没有显著提高转化率。4.重桥连二硫键通过C-S键裂解产生均裂和氢转移产Arbuscular mycorrhizal symbiosis物离子。5.相比于HCD,UVPD明显提高了完整蛋白的二硫键裂解效率和序列覆盖率。6.通过HCD或UVPD MS/MS分析,二硫键的重桥连提高了完整蛋白的二硫键裂解效率。7.通过HCD或UVPD MS/MS分析,酶解肽的二硫键重桥连可以提高二硫键裂解效率。结论:1.DVP可以高效重新桥连蛋白质的二硫键,并具有高度的结构选择性。2.相比于HCD,193 nm UVPD增强了完整蛋白的二硫键解离。3.重桥连增强了完整蛋白和酶解肽二硫键的紫外光解离。4.重桥连提高了HCD裂解完整蛋白和酶解肽二硫键的能力。