背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,全球每年有超过80万例的新发病例。其中,我国每年新发病例数约占全球的一半。HCC起病隐匿,超过80%的患者诊断时已至晚期,失去了根治性手术的机会,需接受系统性治疗。随着医学技术的不断进步,目前已经开发出多种系统性治疗方法应用于晚期HCC,如受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)抑制剂和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂等,但疗效有限。基于免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的免疫治疗给肿瘤患者带来了新的希望。然而其客观反应率(objective response rate,ORR)不到30%,疗效仍不尽如人意。肿瘤免疫治疗的研究离不开对肿瘤免疫微环境(tumor immune microenviroment,TIME)组成和功能的了解。然而,目前对HCC免疫微环境的解析尚不全面。TIME包含多种免疫活性细胞及免疫抑制细胞,是高度异质且复杂的。传统的高通量转录组测序(bulk RNA sequencing,bulk RNA-seq)技术将数以百万计的细胞进行集中测序,结果展示的只是大量细胞的平均表达或者是优势细胞群的表达水平,造成很多信息的缺失且忽视了细胞间的异质性。随着单细胞分离,基因扩增及测序技术的飞速发展,单细胞转录组测序(single cell RNA,sc RNA-seq)技术应运而生。该技术能对单个细胞的转录水平进行测序,可以准确地分析每一个细胞的基因表达水平且最大程度解析样本内的异质性。尽管科学家们已经在一定程度上解析了HCC的免疫细胞图谱,但HCC免疫抑制细胞的功能状态,尤其是免疫抑制细胞亚群的临床意义以及细胞间通讯尚需进一步探索。目的:本研究拟利用10X genomics单细胞RNA测序平台探索HCC免疫抑制细胞的构成及其功能状态,并对挖掘出来的关键细胞亚群和分子进一步验证。同时应用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库和本地患者队列进一步揭示关键细胞亚群的临床意义。尝试在单细胞视角下解析肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中复杂的相互作用网络,探究免疫抑制微环境中占主导的免疫检查点通路,为临床开发免疫治疗的新靶点及进一步优化免疫联合治疗提供理论基础。方法:1.sc RNA-seq及生信分析:将3例人HCC肿瘤及与其配对的3例癌旁组织进行组织解离,制备单细胞悬液,建库和上机测序。然后对下机数据进行质控及去批次。通过Seurat软件对各细胞亚群进行无监督聚类及注释分析。使用Monocle2进行发育轨迹分析,以探索细胞间潜在的谱系分化发育关系。通过基因集变异分析(gene set variation analysis,GSVA)进行功能富集分析。单细胞调节网络推理和聚类(single-cell regulatory network inference and clustering,SCENIC)用于分析不同细胞亚群间转录因子调控。使用Infer CNV推测细胞的拷贝数变异(copy number variation,CNV)用来识别是否为真肿瘤细胞。进一步通过Cell Phone DB2推算TME中复杂的细胞间相互作用网络。在各细胞亚群分析中,差异倍数(fold change,FC)>2且校正后的P<0.05的基因被定义为标记基因,细胞亚群分子标签值定义为log2转化后的平均标记基因TPM值。2.选取6例HCC患者的肿瘤病理组织切片,应用多色免疫荧光技术验证sc RNA-seq研究中发现的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAMs)亚群。此外,我们还通过收集5例HCC患者的新鲜肿瘤组织样本,应用流式细胞技术检测不同TAMs细胞亚群间免疫抑制分子的表达情况。我们随后还选取了6对HCC患者的肿瘤和肿瘤旁病理组织切片,应用多色免疫荧光技术进一步检测调节性树突状细胞(dendritic cell,DCs)的分布。同时我们还应用流式细胞术进一步检测5例新鲜肿瘤组织样本中调节性DCs细胞亚群和其他DCs细胞亚群间功能分子的表达差异。3.为探讨各细胞亚群的丰度和患者总生存率(overall survival,OS)的关系。本研究首先选取了TCGA数据库中369例HCC患者(TCGA LIHC队列)的RNA测序数据,通过转录本相对占比进行细胞类型识别(cell type identification by estimating the relative subsets of RNA transcripts X,Cibersort X)的机器学习算法来推算本研究中所鉴定的细胞类型在每个患者中的相对丰度。通过单因素Cox回归分析筛选和OS相关的细胞亚群。同时结合患者的年龄,性别,分级和TNM分期等临床资料,采用多因素Cox回归分析该关键细胞亚群丰度是否可以作为HCC患者的独立预后指标。4.本研究还纳入2019年10月至2020年01月在我院行手术治疗的42例HCC患者作为本地队列,进一步证实经TCGA数据库筛选的关键细胞亚群丰度的独立预后价值。本研究根据美国癌症联合会(American Joint Commitselleck激酶抑制剂tee on Cancer,AJCC)提出的TNM分期方案对HCC患者进行分期。肿瘤分级依照Edmondson-steiner病理分级标准。42例患者的组织样本均经过组织解离,制备单细胞悬液,应用流式细胞技术检测该细胞亚群的丰度。考虑到术后短时间内复发风险最高,之后逐渐降低,患者随访方案如下:术后的第1年每2-3个月随访一次,1年之后每3-4个月随访一次。本地队列的主要研究终点是OS。5.基于RTKs基因家族的表达模式,通过机器学习算法XGBoost来构建用于预测索拉非尼治疗有效性的模型。选用基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)GSE109211数据集中应用索拉菲尼治疗的HCC患者(N=140),通过R caret包随机分为训练集(N=70)和验证集(N=70)。同时采用TCGA数据库中应用索拉非尼治疗的HCC患者作为外部测试集。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)用于评估模型的敏感性和特异性。6.通过体外免疫细胞介导的细胞毒性实验,进一步探讨阻断TIGIT-PVRmedical insurance/PVRL2轴对HCC的治疗潜力。我们还采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞毒性实验上清液中免疫细胞分泌颗粒酶B(granzyme B,GZMB)的浓度。结果:1.TAMs细胞浸润特征分析及验证(1)TAMs细胞聚类分析和验证:通过对髓系细胞无监督聚类发现,TAMs细胞呈现两分类(VCAN+TAMs和C1QC+TAMs),且这两群细胞同时表达M1和M2型TAMs相关基因。免疫荧光检测显示肿瘤组织中VCAN+TAMs和C1QC+TAMs的特异性标记基因S100A8和SLC40A1呈互斥信号,结果表明HCC组织中存在两群不同的巨噬细胞。(2)VCAN+TAMs和C1QC+TAMs两种细胞亚群的功能差异分析和验证:拟时序轨迹分析发现VCAN+TAMs细胞可极化为C1QC+TAMs细胞,同时M2评分也随之显著增加。在这一分化过程中,我们发现抑制性分子均上调,而辅助激活因子均下调。应用流式细胞术进一步证实相较于VCAN+TAMs细胞亚群,C1QC+TAMs细胞亚群显著高表达免疫抑制分子LAIR1和CD276。GSVA富集分析显示补体激活和细胞因子通路在VCAN+TAMs细胞中显著富集,而TGF-β1信号通路,WNT信号通路和肝癌转移通路在C1QC+TAMs细胞中特异性富集。(3)C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素:在TCGA LIHC队列中,通过单因素Cox分析发现C1QC+TAMs细胞亚群丰度与HCC患者较差的OS相关。多因素Cox回归分析发现C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素。在42例本地患者队列中,多因素Cox分析仍表明C1QC+TAMs细胞亚群丰度是一个独立于其他临床因素(年龄,性别,分级和TNM分期)的预后指标。结果表明C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素。2.DCs细胞浸润特征分析及验证(1)调节性DCs细胞表型的分析及验证:本研究发现HCC肿瘤组织中调节性DCs细胞亚群(LAMP3+DCs)高表达激活状态相关基因(CD80和CD83等);迁移相关基因(CCR7和FSCN1等);以及免疫抑制相关基因(CD274和PDCD1LG2等)。免疫荧光检测发现调节性DCs细胞主要存在于HCC肿瘤组织中。流式细胞技术分析显示HCC肿瘤组织中LAMP3+DCs细胞CCR7,CD80和CD274的表达显著增高。研究结果进一步佐证LAMP3+DCs细胞的迁移,激活和免疫调节特性。(2)调节性DCs细胞的功能分析:GSVA功能富集分析显示免疫应答激活和抗原呈递通路在调节性DCs细胞中均下调,而细胞因子-细胞因子受体相互作用在调节性DCs细胞中上调。且调节性DCs细胞高表达募集Treg细胞的细胞因子。在TCGA LIHC队列中,调节性DCs与Treg细胞的分子标签存在正相关。3.TME中抑制性细胞亚群的互作形成免疫抑制生态位基于细胞间通讯分析,本研究发现C1QC+TAMs细胞,调节性DCs细胞,Treg和耗竭性CD8+T细胞之间存在较强的细胞共抑制,共刺激,趋化和粘附的相互作用,从而形成免疫抑制生态位。调节性DCs细胞高表达CD80/CD86,ADORA2A和CD70,分别与Treg细胞上的CTLA4/CD28,ENTPD1和CD27结合,并可通过CCL19-CXCR3和CXCL10-CXCR3来募集Treg细胞。此外,调节性DCs细胞不仅可通过经典的免疫抑制途径,也可通过一种非经典免疫抑制途径TIGIT-PVR/PVRL2轴与耗竭性CD8+T细胞相互作用。C1QC+TAMs细胞和Treg细胞之间通过趋化因子(CCL18-CCR8)相互作用,进一步激活TME中Treg细胞的免疫抑制活性。C1QC+TAMs细胞通过免疫调节分子(HAVCR2-LGALS9)与耗竭性CD8+T细胞相互作用促进CD8+T细胞的耗竭。同时,在TCGA LIHC队列中,研究结果表明调节性DCs细胞,Treg细胞,耗竭性CD8+T和C1QC+TAMs细胞的分子标签呈现显著正相关。4.HCC肿瘤细胞具有瘤内外的异质性(1)HCC肿瘤细胞CNV模式分析:HCC肿瘤细胞的CNErastin纯度V分析显示每例HCC患者均存在特定的CNV模式。(2)HCC肿瘤细胞RTKs基因家族表达模式分析及索拉菲尼治疗预测模型的构建和评估:本研究进一步分析了RTKs基因家族在肿瘤细胞中的表达谱,结果显示RTKs基因表达也以患者特异的方式富集。基于RTKs基因家族的表达模式,我们通过机器学习算法XGBoost构建模型来预测HCC患者应用索拉非尼治疗的完全缓解或部分缓解(complete response or partial response,CR/PR)。结果显示验证集ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)为0.982,测试集AUC值为0.889。结果表明该模型可以有效预测HCC患者应用索拉菲尼治疗的疗效。(3)HCC肿瘤细胞中不同细胞亚群及患者间信号通路富集分析:利用GSVA功能富集分析发现不同HCC患者中存在不同的肿瘤细胞信号通路富集。此外,不同细胞亚群间信号通路的富集也不同,显示肿瘤细胞呈瘤内外的异质性。5.TIGIT-PVR/PVRL2轴是HCC患者潜在的免疫治疗靶点(1)肿瘤浸润免疫细胞和抗原提呈细胞间的通讯分析:本研究通过评估共抑制和共刺激免疫检查点在形成HCC免疫抑制微环境中的相对贡献时发现共抑制信号TIGIT-PVR/PVRL2轴在肿瘤浸润免疫细胞和抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)通讯中占主导地位。肿瘤浸润免疫细胞和APCs细胞未通过经典的免疫抑制CTLA4-CD80/CD86和PD-1(PDCD1)-PD-L1/L2(CD274/PDCD1LG2)通路形成有效的通讯。(2)PVR/PVRL2表达和预后分析:TCGA LIHC转录组数据显示,HCC肿瘤组织中PVR和PVRL2显著上调。分析来自人类蛋白图谱数据库(human protein atlas,HPA)的免疫组化(immunohistochemistry,IHC)数据,我们发现与正常肝脏样本相比,HCC肿瘤组织高表达PVR和PVRL2。在TCGA LIHC队列中,PVR和PVRL2的高表达与HCC患者较差的OS存在显著相关。(3)阻断TIGIT-PVR/PVRL2轴可增强免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用:体外免疫细胞介导的细胞毒性实验显示,对肝癌细胞系进行PVR或PVRL2抗体阻断或对免疫细胞进行TIGIT阻断均可增强免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。研究结果表明在增强免疫反应的同时还伴有上清液中GZMB的分泌增多。结论:1.HCC肿瘤微环境中TAMs细胞呈现VCAN+TAMs细胞和C1QC+TAMs细胞两种细胞分类,既往应用M1和M2型的TAMs细胞分类方法则存在一定的局限性。此外,C1QC+TAMs细胞亚群丰度是HCC患者预后的独立危险因素。2.HCC患者的调节性DCs细胞具有迁移,激活和免疫调节特性。3.C1QC+TAMs细胞,调节性DCs细胞,Treg细胞和耗竭性CD8+T细胞之间存在强烈的细胞共抑制,共刺激,趋化和粘附相互作用,进而形成免疫抑制生态位。4.基于转录组,RTKs表达和CNV模式三个维度分析,显示HCC肿瘤细胞呈现瘤内外异质性。5.TIGIT-PVR/PVRL2轴在HCC肿瘤浸润免疫细胞和APCs细胞之间提供显著的共抑制信号,未来可成为潜在的HCC免疫治疗的新靶点。