研究背景与目的腰痛(Low back pain,LBP)及慢性颈痛(Chronic neck pain)是现阶段临床上较为常见的慢性疾病,会给患者的生理和心理造成严重损伤,不仅影响患者的日常生活,也给社会造成庞大的经济负担。椎间盘退行性变(Intervertebral disc degeneration,IDD)是引起腰痛和慢性颈痛的常见病因之一。值得注意的是,在当下VP-16的临床诊疗中,IDD的患者出现了显著的年轻化趋势,这一现象可能与电子产品的不恰当使用以及长时间的高强度工作有关,而随着社会老龄化的加剧,可以预见,未来IDD患者的数量将会进一步增多。当前,IDD的具体发病机制仍不是十分透彻,临床上尚缺乏行之有效的基于分子靶点的精准非手术治疗方案,所以患者主要通过手术moderated mediation治疗解决IDD引起的神经受压症状,但是手术治疗仅能改善相应的神经受压症状,无法从根本上解决椎间盘退变进展的问题,除此之外,手术治疗也会改变脊柱相应节段的原本解剖学结构和脊柱整体的生物力学,毗邻节段的椎间盘受到的应力增加会导致邻椎病(Adjacent segment disease,ASD)的发生几率显著升高。因此,IDD进展过程中具体机制的探究对于椎间盘退变的治疗有着至关重要的意义。椎间盘的解剖学结构包括髓核(Nucleus Pulposus,NP)、纤维环(Annulus Fibrosus,AF)以及软骨终板(Cartilaginous Endplates,CEP),中央的髓核被外周的纤维环紧紧包绕,上下附以软骨终板,形成一个类似于“三明治”的解剖结构。作为全身最大的无血管神经组织,椎间盘长期处于低氧、低糖、低PH值、高负荷波动以及高渗的恶劣环境中。在椎间盘退变的整体进展中,IVD水分不断丢失且椎间高度逐渐下降。磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)检查对生物体内的水分成像较为敏感,故而常可在患者的MRI检查的T2加权成像中观察到脊髓信号强度的改变以及椎间高度的降低,且临床诊疗中常用于明确椎间盘退变程度的Pfirrmann分级标准也主要依托于患者MRI检查下的影像学表现。目前的研究表明,NP的退变在整个椎间盘的退变机制中具有重要意义,其发生的病理生理变化包括氧化应激发生、细胞自噬、细胞凋亡与细胞增殖、细胞焦亡以及炎症反应的发展与细胞外基质(ExtracelCH-223191供应商lular matrix,ECM)代谢紊乱等,其中炎症反应的发生发展以及细胞外基质代谢紊乱占据主导地位。细胞外基质的代谢紊乱主要表现为炎症引起的分解代谢增加和合成代谢减低。研究表明IL-1β和TNF-α作为经典炎症因子均能显著诱导椎间盘退变的发生与进展。但是由于两者均广泛存在于哺乳动物的各个器官和组织中,缺乏组织特异性,故而基于这两种炎性因子的抗炎药物在进行临床转化时存在较多问题与挑战。当下IDD领域的研究多集中于上游基因通过下游靶点参与调控髓核ECM的代谢和成分,而ECM具有众多重要的生物学功能,因此凸显出髓核ECM的构成成分对于髓核细胞退变以及对髓核ECM代谢平衡的作用机制研究的重要性。临床诊疗中所应用的椎间盘退变程度分级为Pfirrmann分级标准,PfirrmannⅣ和Ⅴ级的椎间盘突出部分常伴随着骨化,严重压迫脊髓神经根。此外,当前大量研究均表明椎间盘退变与组织骨化息息相关,因此骨化相关基因也同样在椎间盘退变中发挥重要作用。整合素结合涎蛋白(Integrin binding sialoprotein,IBSP),也称为骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)于1992年被首次分离并发现这一基因位于染色体4q21-q23,并包含了6个小外显子(51-159bp)以及一个大外显子(～2.6kb)。IBSP属于小的整联蛋白结合配体N联结糖蛋白家族(Small Integrin-Binding Ligand N-linked Glycoproteins,SIBLING),这一家族与细胞外基质紧密相关。IBSP主要负责编码一种含有317个氨基酸的主要在骨组织中表达的分泌性糖蛋白,这一分泌性糖蛋白是骨细胞外基质中一种十分丰富的蛋白质,并被发现具有一些重要的生理功能,包括促进细胞附着、羟基磷灰石(HA)的成核以及结合胶原蛋白等。SIBLING家族中的IBSP能够特异性的结合并激活基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMP),激活后具有促进血管生成能力。这些特点提示在椎间盘中,IBSP造成的基质金属蛋白酶升高可能诱发炎症发展以及血管长入均表明其可能具有促进疾病进展的作用。但现阶段所发表的研究尚未阐述IBSP在IDD疾病进展中的作用,仅有文献指出IBSP能够在关节软骨、纤维环和髓核细胞中表达。本文作者所在的课题组在前期研究中,对术中摘除的正常和退变的椎间盘髓核组织进行蛋白质组学以及RNA组学的测序,联合分析发现相较于对照组,退变组中的骨化相关基因IBSP存在明显的差异表达现象,提示其可能在椎间盘退变中发挥重要作用。因此,基于上述基础,本课题旨在对骨化相关基因IBSP在椎间盘退变中的作用及其具体作用机制进行深入研究,拟为将来针对椎间盘退变的分子靶点治疗提供相关理论基础。第一部分:椎间盘髓核组织中IBSP的表达水平方法:(1)按照Pfirrmann分级标准分别收集术中正常及退变的椎间盘组织,并提取人椎间盘组织中的髓核细胞。(2)通过在37℃含有5%的CO2的环境下使用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行体外培养,每2-3天进行一次细胞换液,在将细胞培养至细胞融合80%后进行细胞传代实验。(3)通过蛋白质组学与RNA组学的联合分析探究椎间盘髓核退变过程中的关键差异基因。(4)利用实时定量PCR法检测退变髓核细胞中相关目的基因的表达量。(5)对不同分组中小鼠椎间盘进行免疫组化分析以检测目的基因的表达量。(6)通过使用经典炎症因子IL-1β(25ug/ml)或者TNF-α(50ug/ml)单独干预72小时的方式构建体外髓核细胞退变模型,并分别收集不同处理分组下髓核细胞的总蛋白以及总RNA,并通过蛋白质印迹法和实时定量PCR法检测不同组中IBSP的蛋白以及m RNA水平。(7)利用酶联免疫吸附剂试剂盒检测两种炎症因子不同浓度干预后椎间盘髓核细胞中的IBSP的蛋白水平。结果:(1)成功提取并在体外培养出形态优良的人来源的呈梭型的髓核细胞。(2)蛋白质组学与RNA组学的联合分析发现髓核退变后IBSP出现显著的差异表达。(3)相较于对照组,退变椎间盘髓核细胞的IBSP和MMP3的表达水平显著升高,而基质合成相关基因的水平则显著降低。(4)免疫组化也发现退变的髓核组织中IBSP表达水平显著升高。(5)实时定量PCR法以及Western Blot技术实验发现两种不同的经典炎症因子分别干预72小时后所构建的退变模型组中IBSP的表达水平均显著高于空白对照组中IBSP的表达水平。(6)ELISA实验分析发现髓核细胞中IBSP的水平与炎症因子的浓度呈明显的正相关关系,直至达到饱和。结论:通过对人来源的原代细胞的培养能够获得形态优良的呈梭型的椎间盘髓核细胞。退变的髓核细胞中,IBSP的蛋白水平和RNA水平均明显高于对照组。第二部分:IBSP对椎间盘退变进程的影响方法:(1)将收集到的人原代髓核细胞体外培养至P2代后进行后续实验。(2)验证设计的IBSP si RNAs的效率。(3)分别进行IBSP过表达干预以及si RNA si IBSP转染以调控IBSP水平,处理48h后,相应处理即实验组:正常髓核细胞通过过表达质粒进行IBSP过表达干预,正常髓核细胞通过si IBSP进行IBSP敲低干预;对照组则为未处理的正常髓核细胞。(4)此外,通过两种经典炎症因子分别构建的体外椎间盘髓核细胞退变模型,并分别进行IBSP过表达干预以及si RNA si IBSP转染,处理48h后,此即实验组:体外退变模型中的髓核细胞进行IBSP过表达干预,体外退变模型中的髓核细胞进行si IBSP转染;对照组为未处理的体外退变模型中的髓核细胞。(5)通过Trizol法收集以上各组髓核细胞中的总RNA,逆转录成c DNA后利用Real-time技术检测各组中目的基因的RNA表达水平。(6)对正常的髓核细胞组,体外退变的髓核细胞模型空白组,体外退变的髓核细胞模型进行IBSP过表达干预组以及体外退变的髓核细胞模型进行si IBSP转染组利用细胞迁移侵袭试验技术检测各组中MMP的表达差异。结果:(1)成功建立体外培养的髓核细胞系6株。(2)设计的si IBSP转染后能够显著抑制髓核细胞中IBSP的水平。(3)在体外椎间盘髓核细胞退变模型组中,过表达IBSP后的髓核细胞表达的MMP1、MMP3、MMP9、ADAMTS4和ADAMTS5水平显著高于对照组,而si IBSP转染组则出现完全相反的结果。但在正常髓核细胞中,si IBSP转染后仅对MMP1和ADAMTS4有抑制作用。(4)在体外椎间盘髓核细胞退变模型组中,过表达IBSP后的髓核细胞表达的ACAN、COL2和CHSY1水平显著低于对照组,而si IBSP转染组则出现完全相反的结果。而在正常髓核细胞中,si IBSP转染后仅对COL2有显著促进作用。(5)Transwell实验表明过表达IBSP后,髓核细胞的MMPs分泌量显著增加,而si IBSP则显著抑制了髓核细胞的MMPs分泌量。(6)过表达IBSP能够显著增加髓核细胞的凋亡水平,而si IBSP显著抑制了这一表型。结论:获得人的正常髓核细胞株6株。通过Real-time PCR技术以及Transwell技术发现在体外椎间盘髓核细胞退变模型中,过表达IBSP能够显著促进炎症相关基因的表达以及髓核细胞的凋亡水平,并抑制基质合成相关基因的表达,而降低IBSP水平后则明显相反。但在正常髓核中敲低IBSP对表型的改变不显著可能与正常髓核组织中IBSP本身分泌量较低有关。第三部分:IBSP通过Integrinαvβ3/SRC/AKT3促进椎间盘退变的机制研究方法:(1)利用高通量测序技术,探寻在椎间盘退变进展过程中IBSP作用的下游靶基因。(2)通过生信分析探寻IBSP促进椎间盘髓核细胞退变的潜在机制。(3)通过qPCR验证由转录组测序进行生信分析后筛选出的IBSP在IDD中的潜在下游靶基因。(4)利用体外挽救(Rescue)实验深入验证筛选出的IBSP下游靶基因。(5)利用多克隆抗体以及重组蛋白调控髓核组织细胞外IBSP蛋白水平,以明确IBSP对下游靶基因的调控以及对髓核细胞的作用。(6)利用针刺法构建小鼠椎间盘退变模型,通过不同组给药的处理,以体内实验的方式进一步明确IBSP在椎间盘退变中的作用机制。结果:(1)通过高通量转录组测序技术,发现与对照组相比,IBSP si RNAs处理后的体外退变模型的髓核细胞转录组水平基因表达存在显著差异。(2)将测序结果进行生信分析后明确潜在的下游靶基因。(3)基于qPCR验证和筛选,发现在椎间盘退变中,AKT3可能为IBSP的下游靶基因。(4)Rescue实验通过综合调控下游关键分子的水平提示在椎间盘退变中IBSP顺序调控Integrinαvβ3/SRC/AKT3。(5)IBSP重组蛋白干预髓核细胞后显著抑制了AKT3以及p-AKT3的表达水平,并且激活了炎性相关基因MMPs和ADAMTS4水平,同时降低基质合成相关基因ACAN、CHSY1等的表达情况,而多克隆抗体干预后则呈现明显相关的结果,此外利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术提示IBSP重组蛋白调控后髓核细胞凋亡显著增加,而多克隆抗体调控后髓核细胞凋亡明显降低。(6)免疫组化实验明确了不同组中关键分子的表达水平。结论:在IDD进展中,IBSP具有显著的促炎、抑制髓核ECM合成以及促进髓核细胞凋亡的作用。并且证实了IBSP是通过调控下游的Integrinαvβ3/SRC/AKT3轴才得以发挥上述作用。第四部分:麝香酮通过AKT信号通路缓解IBSP促进的椎间盘退变方法:(1)利用qPCR实验筛选在体外实验中能够缓解由IBSP诱导的椎间盘退变的中药。(2)进一步明确筛选出的中药对由IBSP诱导的椎间盘髓核细胞退变表型的调控。(3)利用高通量测序技术联合生信分析探究筛选出的中药在IDD中的潜在下游靶点,并利用qPCR进行验证。(4)利用体外Rescue实验深入验证由生信分析筛选出的下游靶基因。结果:(1)通过qPCR筛选发现麝香酮能够显著缓解由IBSP诱导的椎间盘退变。(2)麝香酮可调控由IBSP诱导的髓核细胞的退变表型。(3)测序结果进行生信分析后通过qPCR验证发现在椎间盘退变进展过程中,AKT信号通路可能为麝香酮作用的下游靶点。(4)Rescue实验通过综合调控下游AKT的水平提示在椎间盘退变中麝香酮通过调控AKT信号通路参与疾病的进展。结论:在IBSP诱导的椎间盘退变中,麝香酮可通过调控AKT信号轴缓解椎间盘退变,从而发挥保护椎间盘的作用。小结本研究首次阐述了骨化相关基因IBSP在髓核细胞中的作用,通过分子实验表明IBSP在退变髓核细胞中的表达水平升高,通过调控IBSP水平发现IBSP能够促进炎症相关基因的表达,并同时抑制髓核细胞基质合成相关基因的表达。通过对多组不同IBSP水平的体外退变髓核细胞进行转录组测序及生信分析,首次发现在IDD进展中,Integrinαvβ3/SRC/AKT3轴是IBSP的潜在下游靶点,并利用挽救实验进行验证。在利用中药缓解IBSP诱导的IDD研究部分中,首次发现麝香酮能够通过AKT信号通路有效缓解IBSP诱导的髓核细胞退变。通过上述研究证明了在椎间盘退变中,IBSP通过Integrinαvβ3/SRC/AKT3轴调控髓核细胞的退变表型,发挥着促进炎症、抑制髓核细胞的细胞外基质合成以及促进髓核细胞凋亡的作用,从而促进椎间盘退变,而这一效应可被麝香酮通过AKT信号通路有效缓解。